【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及生物聚合物的体外产生。一些实施例涉及在大豆和玉米无细胞系统中产生例如多肽、多核苷酸和/或多糖。
技术介绍
1、对于在多种应用中使用，相比于常规的体内蛋白质表达系统，无细胞表达系统是更好的。例如，当在活细胞中表达时，许多生物聚合物难以产生、不稳定、有毒或易于裂解性降解。此外，从原核宿主细胞或真核宿主细胞中纯化生物聚合物可能存在安全性问题，例如当宿主细胞通常不被认为是安全的时和/或当难以将生物聚合物与宿主细胞中存在的潜在毒素、过敏原或其他杂质分离时。因此，在一些情况下，对于在生产药物或食品产品中使用，无细胞表达系统是合意的。
2、在农业领域，转基因产物(例如，rna、sirna、基因编辑机器和蛋白质)在作物植物中的表达可以为农民提供极其重要的益处。例如，转基因蛋白提供增加的作物产量、使用更安全和/或更有效的除草剂、减少的对杀虫剂使用的需要、以及通过减少或消除对耕种的需要来保持土壤。然而，转基因在植物中的表达是一个复杂的过程。转基因产物的正确表达(包括合意水平的表达)受到包括基因转录、翻译、蛋白质折叠、糖基化和磷酸化在内的各种复杂过程的影响。这些过程中的每一个都依赖于植物细胞中的不同酶、官能团供体和辅因子。在不同的植物类型中，这些的组合效应可能是不可预测且可变的。因此，为了实现功能性转基因的基因产物的最佳表达，必须选择适当的转录元件(如增强子和启动子)，经常改变转基因编码序列(例如，通过密码子优化)，可以添加、去掉或修饰非编码内含子序列，并且必须考虑和评价植物细胞正确折叠和修饰新翻译的蛋白质(例如，通过连接聚糖或
3、与基于转化的植物或组织的表达相比，无细胞蛋白质表达植物系统(“cfps”)提供了诸如更短的加工时间以及直接控制和监测反应条件的优点。swartz(2012)，同上。因此，cfps使得更简单且更快速地筛选大量变量以确定哪些因子实现或改善转基因的基因表达，而无需产生转基因组织/植物(或在产生转基因组织/植物之前)，产生转基因组织/植物可能是劳动密集型、耗时且需要空间的过程。例如，pcr产物可以直接用于同时表达多种蛋白质，而无需费力的克隆和转化步骤。wu等人(2007)angew.chem.int.ed.engl.[德国应用化学英语国际版]46(18)：3356-8；yabuki等人(2007)j.struct.funct.genomics[结构与功能基因组学杂志]8(4)：173-91；gan和jewett(2014)biotechnol.j.[生物技术杂志]9(5)：641-51。cfps平台允许添加促进蛋白质折叠的辅助因子(ozawa等人(2005)j.biomol.nmr[生物分子核磁共振杂志]32(3)：235-41；endo等人(2006)mol.biotechnol.[分子生物技术]33(3)：199-209；matsuda等人(2006)j.struct.funct.genomics[结构与功能基因组学杂志]7(2)：93-100)。它们还促进不能在活细胞中产生的细胞毒性蛋白的表达。xu等人(2005)appl.biochem.biotechnol.[应用生物化学与生物技术]127(1)：53-62；schwarz等人(2008)proteomics[蛋白质组学]8(19)：3933-46；xun等人(2009)protein expr.purif.[蛋白质表达与纯化]68(1)：22-7。
4、大肠杆菌(escherichia coli)无细胞裂解物被广泛使用，并且由于其低成本、可放大性和高生产率而具有优势。zawada等人(2011)biotechnol.bioeng.[生物技术与生物工程]108(7)：1570-8；caschera和noireaux(2014)biochimie[生物化学]99：162-8。然而，因为裂解物来源于细菌，所以它们由于低效的氧化折叠以及不存在伴侣和糖基化机器而不适合于产生具有多个亚结构域的复杂蛋白质。真核无细胞系统更适合于表达此类蛋白质，并且支持大多数形式的翻译后修饰。chang等人(2005)j.mol.biol.[分子生物学杂志]353(2)：397-409；zhang和kaufman(2006)handb.exp.pharmacol.[实验药理学手册](172)：69-91。最常用的系统基于小麦胚芽提取物(wge)、昆虫细胞提取物(ice)和兔网织红细胞裂解物(rll)。然而，这些系统是昂贵的，并且提取物制备是复杂的。carlson等人(2012)，同上。这产生了对另外的真核cfps的需求，这些另外的真核cfps如基于蜥蜴利什曼原虫(leishmania tarentolae)(mureev等人(2009)nat.biotechnol.[自然·生物技术]27(8)：747-52)、中国仓鼠卵巢(cho)细胞(brodel等人(2014)biotechnol.bioeng.[生物技术与生物工程]111(1)：25-36)和酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)(hodgman和jewett(2013)biotechnol.bioeng.[生物技术与生物工程]110(10)：2643-54；gan和jewett(2014)，同上)的那些。基于植物的无细胞表达系统也描述于美国专利号10,612,031中。
5、然而，关于基因在以下商业上重要的作物植物中的表达，使用前述无细胞系统通常是不合适的或者信息较少：大豆和玉米。大豆(soybean/glycine max)和玉米(maize/zeamays或corn)是世界上种植最多的转基因作物种子。大豆是世界上最大的动物蛋白饲料来源和第二大植物油来源。它也用于食品产品，如酱油和豆腐。根据美国农业部(unitedstates department of agriculture，“usda”)和国际农业生物工程应用技术采购管理局(international service for the acquisition of agri-biotech applications，“isaaa”)的信息，发现经基因修饰的大豆占美国种植的田地的94％，占巴西种植的田地的97％，占加拿大种植的田地的83％，并且占全球种植的大豆田地的78％-82％。基于生产水平，玉米是美国最大的饲料谷物来源，并且是全球最重要的谷物来源。它也用于生产玉米甜味剂和燃料用乙醇。近年来，全球玉米生产水平已经超过10亿公吨/年。发现经基因修饰的玉米占美国田地的92％，并且已经在南美玉米生产国家(如巴西和阿根廷)广泛采用经基因修饰的玉米。
6、为了评价靶基因产物在大豆或玉米中的转基因表达，当前正在在转基因植物组织中(在植物中(in planta)或在植物外(ex planta))进行测试。这种植物组织可以通过稳定或瞬时转化方法产生。虽然稳定转化的植物更可能提供关于转基因表达的可靠、长期且实验可重复的信息，但稳定转化方法可能非常耗时、昂贵且效率非常低。涉及稳定转化的项目可能需要筛选数百或数千种植物以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于合成至少一种多肽的方法，所述方法包括
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中从经匀浆的大豆微小原生质体制备所述细胞裂解物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括合成约100μg/mL或更多的所编码的多肽，其中mL是指所述反应体积。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括合成约200μg/mL或更多的所编码的多肽，其中mL是指所述反应体积。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中从经匀浆的玉米微小原生质体制备所述细胞裂解物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括合成约1μg/mL或更多的所编码的多肽，其中mL是指所述反应体积。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括合成约3μg/mL或更多的所编码的多肽，其中mL是指所述反应体积。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括合成约5μg/mL或更多的所编码的多肽，其中mL是指所述反应体积。
10.一种筛选用于在玉米或大豆中进
11.根据权利要求11所述的方法，所述方法进一步包括将玉米或大豆植物组织用用于进行转基因表达的一个或多个所选核酸编码序列转化，从而产生转基因玉米或大豆植物组织，其中所述细胞裂解物和所述转基因组织属于相同的植物物种。
12.根据权利要求12所述的方法，所述方法进一步包括从所述转基因玉米或大豆植物组织再生转基因植物。
13.一种制备用于合成生物聚合物的细胞裂解物的方法，所述方法包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其中从大豆细胞制备所述原生质体，并且使所述大豆原生质体脱液泡，并且通过珀可梯度分离来分离微小原生质体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中从玉米细胞制备所述原生质体，并且使所述大豆原生质体脱液泡，并且通过碘海醇梯度分离来分离微小原生质体。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中将所述微小原生质体膜在包含HEPES、谷氯酸钾、谷氨酸镁、氧化还原试剂和蛋白酶抑制剂的缓冲液中破坏并匀浆化。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括添加聚合物模板和所述聚合物的单体单元。
18.一种用于合成生物聚合物的试剂盒或系统，所述系统包括反应体积，所述反应体积包含：
19.一种用于合成生物聚合物的试剂盒或系统，所述系统包括反应体积，所述反应体积包含：
20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其中所述玉米或大豆细胞裂解物和所述缓冲液各自在单独的体积容器中提供。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于合成至少一种多肽的方法，所述方法包括
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中从经匀浆的大豆微小原生质体制备所述细胞裂解物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括合成约100μg/ml或更多的所编码的多肽，其中ml是指所述反应体积。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括合成约200μg/ml或更多的所编码的多肽，其中ml是指所述反应体积。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中从经匀浆的玉米微小原生质体制备所述细胞裂解物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括合成约1μg/ml或更多的所编码的多肽，其中ml是指所述反应体积。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括合成约3μg/ml或更多的所编码的多肽，其中ml是指所述反应体积。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括合成约5μg/ml或更多的所编码的多肽，其中ml是指所述反应体积。
10.一种筛选用于在玉米或大豆中进行转基因表达的核酸编码序列的方法，所述方法包括：
11.根据权利要求11所述的方法，所述方法进一步包括将玉米或大豆植物组织用用于进行转基因表达的一个或多个所选核酸编码序列转化，从而产生...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·本特鲁，K·马杜里，S·席尔伯格，S·沃格尔，
申请(专利权)人：科迪华农业科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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