【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子标记，特别是涉及一种鉴定密斑刺鲀、大斑刺鲀和六斑刺鲀的方法。
技术介绍
1、密斑、大斑和六斑刺鲀主要分布于热带和亚热带海域，属鲀形目（tetraodontiformes）、刺鲀科（diodontidae）。因其形态特殊（周身长刺、可鼓气膨大）、肉味鲜美、营养丰富，而深受南方地区老百姓的喜爱，属南海名贵海水鱼类。近些年，从市场上的价格逐年飙升可以反应出刺鲀鱼的生物量处于减少状态，因此，有必要对南海海域刺鲀鱼的种群结构进行调查和评估，同时，刺鲀鱼的人工繁育技术也需要尽快发展起来，以此满足该鱼的市场需要。密斑刺鲀、大斑刺鲀和六班刺鲀从形体上具有较高的相似度，难以通过肉眼准确区分，尤其是密斑刺鲀和大斑刺鲀，相似度非常高。物种区分困难会从根本上限制了刺鲀鱼的资源调查及人工繁育过程中的亲鱼选育。目前，用于鉴定物种种属的常用方法是扩增co1、12s rrna、16s rrna等分子标记并测序，测序结果通过序列比对及进化树分析获得最终的鉴定结果。尽管此种方法精确度高，但周期较长（一个鉴定过程需要3~7天），费用较高，难以满足大批量的鉴定需求，这给物种鉴定及种群选育带来了不便。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种鉴定密斑刺鲀、大斑刺鲀和六斑刺鲀的方法。本专利技术提供的方法不需要进行送样测序，直接根据pcr产物的有无就能对密斑刺鲀、大斑刺鲀和六班刺鲀的个体或者种群进行分子鉴定，精确度高，周期短（1天内完成鉴定），成本低廉，可以实现高通量鉴定。
2、为
3、本专利技术提供了一种鉴定密斑刺鲀、大斑刺鲀和六斑刺鲀的方法，包括以下步骤：
4、以待测样本的基因组dna为模板，利用第一引物对进行第一pcr扩增，利用第二引物对进行第二pcr扩增，根据扩增结果进行鉴定；
5、当第一pcr扩增和第二pcr扩增均得到扩增产物，则待测样本为密斑刺鲀；
6、当第一pcr扩增得到扩增产物，第二pcr扩增未得到扩增产物，则待测样本为大斑刺鲀；
7、当第一pcr扩增和第二pcr扩增均未得到扩增产物，则待测样本为六斑刺鲀；
8、所述第一引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq idno.2所示；所述第二引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列如seq id no.3和seq idno.4所示。
9、优选的，所述第一pcr扩增的反应程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共20个循环；72℃终延伸1min。
10、优选的，所述第二pcr扩增的反应程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共20个循环；72℃终延伸1min。
11、优选的，所述第一pcr扩增或所述第二pcr扩增的反应体系为20μl，包括：上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、模板1μl、premix taq10μl和余量的ddh2o。
12、优选的，所述上游引物在反应体系的浓度为10μmol/l，所述下游引物在反应体系的浓度为10μmol/l。
13、优选的，所述待测样本包括：与密斑刺鲀、大斑刺鲀或六班刺鲀的形体相似的鱼。
14、优选的，所述扩增产物的鉴定方法包括非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
15、优选的，所述扩增产物的鉴定方法还包括非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染。
16、有益效果：
17、本专利技术提供的方法通过第一引物对和第二引物对进行pcr扩增，直接根据pcr产物的有无就能对密斑刺鲀、大斑刺鲀和六班刺鲀的个体或者种群进行分子鉴定，无需进行送样测序，精确度高，周期短（1天内完成鉴定），成本低廉，可以实现高通量鉴定。可以取不同时期、不同来源的三种刺鲀的尾鳍组织，对动物损伤轻微或无损伤，也不需要个体养殖到一定重量，对养殖和生态保护均有帮助。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种鉴定密斑刺鲀、大斑刺鲀和六斑刺鲀的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共20个循环；72℃终延伸1min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共20个循环；72℃终延伸1min。
4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述第一PCR扩增或所述第二PCR扩增的反应体系为20μL，包括：上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、模板1μL、Premix Taq10μL和余量的ddH2O。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述上游引物在反应体系的浓度为10μmol/L，所述下游引物在反应体系的浓度为10μmol/L。
6.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括：与密斑刺鲀、大斑刺鲀或六班刺鲀的形体相似的鱼。<...
【技术特征摘要】
1.一种鉴定密斑刺鲀、大斑刺鲀和六斑刺鲀的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一pcr扩增的反应程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共20个循环；72℃终延伸1min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二pcr扩增的反应程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共20个循环；72℃终延伸1min。
4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述第一pcr扩增或所述第二pcr扩增的反应体系为20μl，包括：上游引...
【专利技术属性】
技术研发人员：马军，岳彦峰，黄海，曹柳，陈燕，陈攀，
申请(专利权)人：海南热带海洋学院崖州湾创新研究院，
类型：发明
国别省市：
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