【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及樱花育种的检测领域，具体涉及一种钟花樱种质资源的indel标记引物组合及其应用。
技术介绍
1、樱花是蔷薇科rosaceae李属prunus樱亚属subg.cerasus植物的统称，因其具有极佳的观赏价值，在园林造景和城市美化方面得以广泛应用。樱属植物主要分布于北半球的温带与亚热带地区，全世界樱属植物150余种，中国有52种及变种，三分之一以上的樱属植物原产于中国。我国樱属植物不仅种类多，变异类型也十分丰富，具有广阔的开发利用前景。钟花樱(prunus campanulata)为落叶乔木，又名钟花樱桃、福建山樱花、寒绯樱等；其花色以绯红为主，花期早、耐热性好、抗性强、观赏价值高，深受南方园林花卉市场的欢迎。
2、我国钟花樱资源丰富，广泛分布于福建、台湾、广东、广西、江西、湖南、云南等省份。钟花樱遗传多样性丰富，是优异樱花种质创制和新品种培育的珍贵材料。近年来，我国育种者先后从钟花樱野生资源中实生选育了一系列新品种，已经报道的有‘惜春’(p.campanulata‘xichun’)、‘相思红’(p.campanulata‘xiangsihong’)、‘湘妍’(p.campanulata‘xiangyan’)、‘灿霞’(p.campanulata‘canxia’)等。近年来，武汉、长沙等地先后建立了国家级樱花种质资源圃(库)，收集了大量的钟花樱种质资源，开展了观赏性评价、遗传多样性分析等研究；制定了钟花樱优株选择、苗木繁育等技术规程；在种质资源的开发利用方面取得了较好的进展，但一定程度上忽视了对种质资源的保
3、目前比较成熟、应用比较广泛的dna指纹图谱构建标记有rapd、issr、indel等，这些技术各有优势。例如，rapd、issr分子标记所需dna量少、操作简单，最突出的优势是不需预知研究对象的基因组序列。indel是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失(insertion-deletion)，是同源序列比对产生空位(gap)的现象。indel变异序列两侧多是相对保守的单拷贝序列，可以通过设计特异性引物，对基因组dna进行pcr扩增，通过检测扩增产物片段长度区分变异，indel分子标记具有数量丰富、多态性高、重复性好、遗传共显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、技术成熟等特点，在植物种质资源dna指纹图谱构建方面具有广阔的应用前景。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，应用indel标记对钟花樱核心种质资源进行检测，通过pcr产物电泳分析，构建了核心种质资源的dna指纹图谱，实现了种质资源的快速、准确区分。
2、为达到上述目的，本方案首先提供了一种钟花樱indel标记引物组合，所述indel标记引物组合包括ide2标记引物组、ide4标记引物组、ide7标记引物组、idg1标记引物组和idh5标记引物组；
3、所述ide2标记引物组的核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示；
4、所述ide4标记引物组的核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.4所示；
5、所述ide7标记引物组的核苷酸序列如seq id no.5～seq id no.6所示；
6、所述idg1标记引物组的核苷酸序列如seq id no.7～seq id no.8所示；
7、所述idh5标记引物组的核苷酸序列如seq id no.9～seq id no.10所示。
8、基于一个总的专利技术构思，本方案还提供了一种钟花樱indel标记引物组合在构建dna指纹图谱鉴定钟花樱种质上的应用，包括以下步骤：
9、s1、采用改良ctab法提取待测钟花樱样本叶片的总dna；
10、s2、以s1步骤提取的总dna为扩增模板，分别以权利要求1所述的5个indel标记引物组进行pcr扩增，得到pcr产物；
11、s3、对s2步骤得到的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，分子量较大的条带记为数字1，分子量较小的条带记为数字2，5组引物扩增的pcr产物电泳条带数字编码排列即为待测钟花樱的dna指纹图谱，根据dna指纹图谱鉴定待测钟花樱种质。
12、作为优选，所述s1步骤待测钟花樱的种质包括7种，分别为湖南汝城县钟花樱种质rc-1、湖南宜章县钟花樱种质yz-3、湖南新宁县钟花樱种质xn-2、湖南东安县钟花樱种质da-1、湖南龙山县钟花樱种质ls-2、福建南平市钟花樱np-4、台湾台北市钟花樱种质tb-3。
13、作为优选，所述s2步骤的pcr扩增的反应体系为：2×taq master mix 12.5μl，10μmol/l的上、下游引物各1μl，ddh2o 9.5μl，50ng/μl的待测试材料的dna 1μl，反应体系共25μl。
14、作为优选，所述s2步骤的pcr扩增的反应程序为：98℃预变性3min；94℃变性15s，54～57℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存；ide4、idg1标记引物组的退火温度为54℃，ide2、ide7标记引物组的退火温度为55℃，idh5标记引物组的退火温度为57℃。
15、作为优选，所述s3步骤的鉴定待测钟花樱种质的方法为：若dna指纹图谱为11112，则为湖南汝城县钟花樱种质rc-1；若dna指纹图谱为12221，则为湖南宜章县钟花樱种质yz-3；若dna指纹图谱为21211，则为湖南新宁县钟花樱种质xn-2；若dna指纹图谱为21112，则为湖南东安县钟花樱种质da-1；若dna指纹图谱为21212，则为湖南龙山县钟花樱种质ls-2；若dna指纹图谱为22121，则为福建南平市钟花樱种质np-4；若dna指纹图谱为21122，则为台湾台北市钟花樱种质tb-3。
16、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
17、(1)本专利技术基于钟花樱基因组重测序技术，首次挖掘出indel位点，并用于构建钟花樱核心种质资源的dna指纹图谱构建，不仅可以为该物种的科学保护提供技术支撑，同时促进新种质创制、新品种培育相关研究；indel分子标记具有数量丰富、多态性高、重复性好、遗传共显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、技术成熟等特点，在植物种质资源dna指纹图谱构建方面具有广阔的应用前景。
18、(2)本专利技术设计的5个indel标记的扩增产物易于区分，不需要聚丙烯酰胺凝胶或毛细管电泳进行检测，仅需普通的琼脂糖凝胶电泳就可检测，分辨率较高。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种钟花樱InDel标记引物组合，其特征在于，所述InDel标记引物组合包括IDE2标记引物组、IDE4标记引物组、IDE7标记引物组、IDG1标记引物组和IDH5标记引物组；所述IDE2标记引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；
2.如权利要求1所述的一种钟花樱InDel标记引物组合在构建DNA指纹图谱鉴定钟花樱种质上的应用，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述S1步骤待测钟花樱的种质包括7种，分别为湖南汝城县钟花樱种质RC-1、湖南宜章县钟花樱种质YZ-3、湖南新宁县钟花樱种质XN-2、湖南东安县钟花樱种质DA-1、湖南龙山县钟花樱种质LS-2、福建南平市钟花樱NP-4、台湾台北市钟花樱种质TB-3。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述S2步骤的PCR扩增的反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，ddH2O 9.5μL，50ng/μL的待测试材料的DNA 1μL，反应体系共25μL。
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。