【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及使用直接扩增的针对病毒和细菌病原体核酸的诊断和检测方法。
技术介绍
0、专利技术背景
1、以下对本专利技术背景的论述仅为帮助读者理解本专利技术而提供，且不承认描述或构成本专利技术的现有技术。
2、通常使用多种方法中的任一种来完成对病毒的临床检测。例如，可从生物学样品(例如鼻咽抽吸物、喉拭样、血液流体、粪材料等)分离病毒颗粒或核酸。可通过血清学进行回顾诊断。在此方法中最广泛使用补体结合测试(cft)，尽管可使用血凝抑制(hai)和酶免疫测定法(eia)来给出类型特异性诊断。对于更迅速的诊断，可实施抗原检测或rna检测。抗原检测可通过ift或eia进行，然而，为了实现最高水平的灵敏性和特异性，使用通过逆转录酶聚合酶链式反应(rt-pcr)的rna检测。然而，后者是昂贵的且技术要求较高的。
3、类似地，可使用多种方法，包括革兰氏染色、培养、微阵列和聚合酶链式反应(pcr)或实时pcr完成细菌检测。与病毒如流感(其具有由rna构成的基因组且因此需要转录步骤来创建靶cdna以用于传统的或实时的pcr)的检测不同，细菌检测可使用标准pcr方案完成。然而，即使在没有额外的rt步骤时，pcr或实时pcr也是费时且昂贵的诊断方法，如下文描述的。
4、rt-pcr是一种用于扩增和量化靶核酸的实验室技术。该规程依照聚合酶链式反应的一般原理，不过在rt-pcr中使用酶逆转录酶将rna链首先逆转录成它的dna互补物(cdna)，并使用传统pcr或实时pcr扩增所得cdna。根据使用
5、鉴于与从生物学样品制备和处理病毒和细菌核酸用于检测、诊断和/或定量有关的高度复杂性，在寻求快速诊断的情况下，存在对牵涉更少的步骤、更少的技术要求和更短的持续时间的方法的需要。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、本专利技术基于允许在没有核酸提取步骤的情况中直接扩增样品的试剂混合物的发现。
2、在一个方面，本专利技术提供一种用于鉴定从人获得的生物学样品中来自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括：(a)在如下的条件下使所述样品与dna聚合酶和缓冲液接触，所述条件适合于在不从所述样品提取所述靶核酸的情况中从所述样品扩增所述靶核酸；(b)将来自步骤(a)的所述样品热循环，从而使得所述靶核酸在存在时得到扩增；并(c)检测存在时从步骤(b)生成的扩增的靶核酸，其中在扩增前不提取样品核酸。
3、在另一个方面，本专利技术提供一种用于鉴定从人获得的生物学样品中来自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括：(a)在如下的条件下使所述样品与dna聚合酶和缓冲液接触，所述条件适合于在不从所述样品提取所述靶核酸的情况中从所述样品扩增所述靶核酸；(b)将来自步骤(a)的所述样品热循环，从而使得所述靶核酸在存在时得到扩增；并(c)检测存在时从步骤(b)生成的扩增的靶核酸；其中在扩增前不从样品提取样品中的核酸，且其中所述缓冲液包含至少一种选自下组的组分：kcl、牛血清清蛋白和表面活性剂。
4、在一些实施方案中，在步骤(a)前不稀释样品核酸。在别的实施方案中，可以在步骤(b)前加热所述样品，或者在又一些实施方案中，在步骤(a)前加热所述样品。可以在步骤(b)前将所述样品于至少约70℃的温度加热至少约2分钟。
5、在别的实施方案中，所述缓冲液可以包含氯化钾(kcl)，且在一些实施方案中，kcl可以以约5mm至约50mm的浓度存在。所述缓冲液还可以包含gotaqtm flexi缓冲液，其在步骤(b)期间可以以1倍至5倍浓度存在。所述缓冲液还可以包含牛血清清蛋白。所述缓冲液可以包含表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂是阳离子型表面活性剂。在又一些实施方案中，dna聚合酶是taq聚合酶。靶核酸可以是dna，或在一些实施方案中是rna。当样品是rna时，可以将其进一步与逆转录酶接触。所述样品可以同时与dna聚合酶和逆转录酶接触。
6、在别的实施方案中，所述样品选自下组：血液、血清、血浆、脑脊髓液、口腔流体和粪。在一些实施方案中，所述样品是全血。在一些实施方案中，所述样品从颊区(buccalregion)获得。在又一些实施方案中，所述微生物可以是病毒，或可以选自下组：流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和肠道病毒。在一些实施方案中，所述微生物还可以是细菌，如在别的实施方案中是艰难梭菌(c.difficile)。
7、如本文中使用的，术语“rna”指与如dna中找到的糖脱氧核糖形成对比包含糖核糖的核酸分子。如本文中使用的，rna指所有种类或rna，包括信使rna(mrna)、核糖体rna(rrna)、转运rna(trna)、以及具有调节功能的小rna种类。“小rna种类”具有特定的意义，并且指在细菌中具有持家或调节作用的非翻译rna。“小rna种类”不是rrna或trna。
8、如本文中使用的，术语“靶核酸”指诊断特定病毒或细菌(包括例如病原体病毒或细菌)的任何核酸分子或片段。靶核酸可以是源自靶物种的dna或rna分子。
9、如本文中使用的，术语“热循环”指使用实验室装置，利用升高的和降低的温度的预编程循环用引物延伸反应来扩增核酸区段的任何技术。热循环的例子包括但不限于pcr、实时pcr和rt-pcr。
10、如本文中使用的，术语“逆转录酶聚合酶链式反应”或“rt-pcr”指用于合成和扩增dna分子(其序列为rna序列的拷贝)的任何技术。rt-pcr可用于检测rna种类(如在基因表达的定量分析中)，以及用于生成rna的dna拷贝，用于克隆、cdna文库构建、探针合成和原位杂交中的信号放大。
11、如本文中使用的，术语“试剂混合物”指具有实施逆转录聚合酶链式反应或实时聚合酶链式反应需要的所有要素的组合物，包含但不限于分别对诊断用靶rna或dna序列具有特异性的引物，和聚合酶。
12、如本文中使用的，“引物”指合成或天然存在的寡核苷酸，其在置于由聚合酶催化互补链合成的条件下时能够充当沿模板链进行核酸合成或复制的启动点。在逆转录的背景内，引物由核酸构成且在rna模板上引发。在pcr的背景内，引物由核酸构成且在dna模板上引发。
13、如本文中使用的，术语“dna聚合酶”指帮助催化脱氧核糖核苷酸聚合成dna链的任何酶。dna聚合酶作用为向新形成链的3’端添加游离核苷酸，导致新链在5’-3’方向上的延长。
14、如本文中使用的，“裂解”意指促进接近或释放细胞rna或dna的对细胞壁或病毒颗粒的扰动或改本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.DNA聚合酶和缓冲液在制备一种用于鉴定从人获得的生物学样品中来自微生物的革巳核酸的存在或缺乏的方法的试剂金中的用途，所述方法包括：
2.权利要求1的用途，其中在步骤(b)前加热所这样品。
3.权利要求2的用途，其中在步骤(a)前加热所这样品。
4.权利要求1的用途，其中在步骤。)前将所这样品于至少约70℃的温度加热至少约2分钟。
5.权利要求1的用途，其中所述缓冲液包含氯化钟(KCl)。
6.权利要求5的用途，其中所述KCl以约5mM至约50mM的浓度存在。
7.权利要求1的用途，其中所述缓冲液包含GoTaqTMFle xi缓冲液。
8.权利要求7的用途，其中所述GoTaqTMFle xi缓冲液在步骤。)期间以1倍－5倍浓度存在。
9.权利要求1的用途，其中所述DNA聚合酶走Taq聚合酶。
10.权利要求1的用途，其中所述微生物走病毒。
【技术特征摘要】
1.dna聚合酶和缓冲液在制备一种用于鉴定从人获得的生物学样品中来自微生物的革巳核酸的存在或缺乏的方法的试剂金中的用途，所述方法包括：
2.权利要求1的用途，其中在步骤(b)前加热所这样品。
3.权利要求2的用途，其中在步骤(a)前加热所这样品。
4.权利要求1的用途，其中在步骤。)前将所这样品于至少约70℃的温度加热至少约2分钟。
5.权利要求1的用途，其中所述缓冲液包含氯化钟...
【专利技术属性】
技术研发人员：M埃克斯纳，L杰基，YP陈，H麦，MM塔布，M艾耶，
申请(专利权)人：探索诊断投资公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。