【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物，具体涉及一种基于表面修饰的碳点检测细菌活性的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
1、细菌活性检测广泛应用于制药、医疗、食品等行业，是药物敏感性测试、杀菌材料开发、食品加工灭菌等领域的重要一环。基于平板培养的菌落计数是评估细菌活性的经典方法，该方法以细菌能否繁殖生长作为判断细菌死活的标准，即在适当的培养基和温度下，可培养的为活菌，不能生长的为死菌。这种基于培养基的方法主要缺点是耗时长以及无法检测出不能繁殖的活菌。此外，菌落计数具有主观性，存在较大误差。pma-qpcr技术是一种新型微生物活性鉴定的常用方法之一。中国专利文献cn115820888a公开了一种基于pma-qpcr技术检测生物样本活菌群的方法，其中pma可选择性透过死细菌的细胞膜，抑制死亡细菌dna检测，只进行活菌dna检测，达到活菌鉴定的目的。此方法可有效解决平板计数中不具备分裂能力的活菌却被误判为死菌的问题。另外此方法大大缩小了检测时间，克服了平板计数耗时长的难题。然而基于核酸扩增的方法只能区分活细菌，无法检测死菌的比例。流式细胞法可通过对处于快速液体流动状态中的单个细菌进行多参数细胞活性和数量分析。即利用一种或两种核酸染料标记细菌，再经激发光照射后产生特异的荧光信号，通过检测荧光信号对细菌数目和比例进行快速检测和分析。流式细胞法通过使用合适的荧光标记物可以区分细菌的活性和死亡状态，直接检测和鉴定活细菌和死细菌，解决了pma-qpcr检测无法区分死细菌的问题。
2、染色法是流式细胞法的主要方法。针对染色法，中国专利文献cn1016201
3、碳纳米点(caron nanodots，cds)又称碳点，是一种新型的零维碳基纳米材料，具有小体积、低成本、易溶于水、低毒性、生物降解高和免疫原性低等优点，在生物体系的荧光标识和体内诊断检测方面应用广泛。目前有报道利用大肠杆菌菌液为原料采用一步水热法制备了高荧光性能碳点(flourescent carbon dots，fcds)，该碳点具有多色特性，表面带有负电荷，与带有负电荷的活菌发生排斥，选择的标记死细菌，从而对死菌进行计数。但是，除在522nm下显示红色信号之外，fcds在488nm激发光下显示为绿色信号，与绿色荧光的细菌活性染料共同用于死菌和活菌检测时，导致活菌信号强度增加，引起活菌检测误差。另外，fcds只能检测死菌，需结合其他染料才能进行活菌检测。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于表面修饰的碳点检测细菌活性的试剂盒及其检测方法。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种基于表面修饰的碳点检测细菌活性的试剂盒，包括叠氮修饰的碳点(rcds@n3)和炔基修饰的碳点(rcds@c≡c)。
4、根据本专利技术优选的，所述叠氮修饰的碳点和炔基修饰的碳点均是以鲍曼不动杆菌为前体合成得到。
5、根据本专利技术优选的，所述叠氮修饰的碳点、炔基修饰的碳点的制备方法，包括步骤如下：
6、(1)将鲍曼不动杆菌接种至lb液体培养基中，培养至菌液浓度为104～109cfu/ml，然后离心、洗涤后，得到鲍曼不动杆菌菌体；
7、(2)向步骤(1)的菌体中添加超纯水，混合均匀后转入特氟隆内衬的不锈钢高压反应釜中，在180～240℃下加热24～48h，通过一步水热法制备得到含碳点的反应溶液，然后将反应溶液冷却、过滤、透析、冷冻干燥后，得到碳点(rcds)；
8、(3)将步骤(2)所得碳点和叠碳乙酸加入至无水dmso中，搅拌12～24h，经透析、过滤、冷冻干燥后，得到叠氮修饰的碳点(rcds@n3)；
9、(4)将步骤(2)所得碳点和3-氨基苯乙炔加入至无水dmso中，搅拌12～24h，经透析、过滤、冷冻干燥后，得到炔基修饰的碳点(rcds@c≡c)。
10、进一步优选的，步骤(1)中，所述离心速度为6000-12000r/min，离心时间为15min。
11、进一步优选的，步骤(2)中，所述过滤是采用0.22～0.48μm的滤膜过滤；所述透析是采用截留分子量为1000da的透析袋透析48～72h。
12、进一步优选的，步骤(3)中，所述碳点和叠碳乙酸的质量比为1：(1～20)；所述碳点和无水dmso的质量体积比为1：(8～12)，单位：g/ml；
13、所述透析是采用截留分子量大于1000da的透析袋透析6次；第一次透析：乙醚透析15～45min、第二次透析为乙醇透析15～45min、第三次透析为5％盐酸透析1～3h、第四次透析为去离子水1～3h、第五次透析0.5mol/l氢氧化钠透析1～3h、第六次透析为去离子水2～8h；所述过滤是采用0.22μm的滤膜过滤。
14、进一步优选的，步骤(4)中，所述碳点和3-氨基苯乙炔的质量比为1：(1～20)；所述碳点和无水dmso的质量体积比为1：(8～12)，单位：g/ml；
15、所述透析是采用截留分子量大于1000da的透析袋透析6次；第一次透析：乙醚透析15～45min、第二次透析为乙醇透析15～45min、第三次透析为5％盐酸透析1～3h、第四次透析为去离子水1～3h、第五次透析0.5mol/l氢氧化钠透析1～3h、第六次透析为去离子水2～8h；所述过滤是采用0.22μm的滤膜过滤。
16、一种利用上述试剂盒检测细菌活性的方法，包括步骤如下：
17、将待检测菌活化培养，得到待检测菌液；然后将叠氮修饰的碳点和炔基修饰的碳点加入至待测菌液中，在20～30℃、黑暗条件下孵育5～10min，得到待检测体系；最后使用荧光显微镜或流式细胞仪观察待检测体系，观察结果中红色荧光信号表示为死细菌，绿色荧光信号表示为活细菌。
18、根据本专利技术优选的，所述待检测菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
19、根据本专利技术优选的，所述待检测体系中，叠氮修饰的碳点和炔基修饰的碳点的总浓度为0.1～0.3mg/ml；叠氮修饰的碳点和炔基修饰的碳点的浓度相同。
20、本专利技术的技术特点：
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1.一种基于表面修饰的碳点检测细菌活性的试剂盒，其特征在于，包括叠氮修饰的碳点(RCDs@N3)和炔基修饰的碳点(RCDs@C≡C)；
2.如权利要求1所述的基于表面修饰的碳点检测细菌活性的试剂盒，其特征在于，所述叠氮修饰的碳点、炔基修饰的碳点的制备方法，包括步骤如下：
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心速度为6000～12000r/min，离心时间为15min。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述过滤是采用0.22～0.48μm的滤膜过滤；所述透析是采用截留分子量为1000Da的透析袋透析48～72h。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述碳点和叠碳乙酸的质量比为1：(1～20)；所述碳点和无水DMSO的质量体积比为1：(8～12)，单位：g/mL；
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述碳点和3-氨基苯乙炔的质量比为1：(1～20)；所述碳点和无水DMSO的质量体积比为1：(8～12)，单位：g/mL；>
7.一种利用权利要求1所述的试剂盒检测细菌活性的方法，其特征在于，包括步骤如下：
8.如权利要求7所述的检测细菌活性的方法，其特征在于，所述待检测菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
9.如权利要求7所述的检测细菌活性的方法，其特征在于，所述待检测体系中，叠氮修饰的碳点和炔基修饰的碳点的总浓度为0.1～0.3mg/mL；叠氮修饰的碳点和炔基修饰的碳点的浓度相同。
...【技术特征摘要】
1.一种基于表面修饰的碳点检测细菌活性的试剂盒，其特征在于，包括叠氮修饰的碳点(rcds@n3)和炔基修饰的碳点(rcds@c≡c)；
2.如权利要求1所述的基于表面修饰的碳点检测细菌活性的试剂盒，其特征在于，所述叠氮修饰的碳点、炔基修饰的碳点的制备方法，包括步骤如下：
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心速度为6000～12000r/min，离心时间为15min。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述过滤是采用0.22～0.48μm的滤膜过滤；所述透析是采用截留分子量为1000da的透析袋透析48～72h。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述碳点和叠碳乙...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭琴燕，张方，李文靖，
申请(专利权)人：山东省大健康精准医疗产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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