【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物，涉及一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
1、细菌活性检测是医药、卫生及食品、工业生产等多个行业质量检测的重要内容，细菌的活性决定其侵袭力，因此必须严格控制微生物含量确保产品符合相关行业标准，并通过探明细菌活性情况为疾病诊断、治疗、分析提供客观依据。在传统方法上，活细菌的数量是通过平板计数法测定，其细菌活性的判定结果完全取决于细胞的繁殖能力，仅对能形成菌落的细菌进行计数，无法提供死亡细菌或存活但不可培养状态细菌的指示。此外，平板计数法由于需要培养，导致其过程耗时长(24～48h甚至更长)，无法快速获得样本中细菌活性情况。除平板计数法外，常见的细菌活性检测方法是基于pcr技术的研究，通过利用可透过细胞膜与死菌dna结合的核酸交联剂以抑制死菌dna扩增；或扩增仅存在于活菌中的mrna，达到检测活菌的目的。但该方法中，死菌的dna或mrna很难完全从样本内完全去除，易导致结果假阳性，无法满足实际需要。因此，目前细菌活性测定仍以与单细胞技术结合检测为主，如流式细胞术、显微镜观察或分子鉴定等。其中流式细胞术由于其测量速度快(达上万个单细胞或颗粒每秒)，目标范围广(细胞、细菌或各种微粒，大小范围在0.5～50μm均可)等优点，其与荧光物质结合使用，可对细菌的结构和功能特性等多参数(如代谢活性、膜电位、膜完整性或大分子生物合成)进行单细胞水平分析，从而对细胞群体更深层的表征。
2、常用于流式细胞仪测定细菌活性的荧光物质主要根据细胞膜完整性或酶活力等指标检测细胞活死状态。
3、近年来，各种发光纳米颗粒如量子点具有低毒性、良好的生物相容性、优异的荧光特性和易于功能化等优点被应用于生物标记领域。其中，氮掺杂碳量子点(n-碳量子点，n-cds)具有独特的荧光性质，可与细胞膜结合显现出明亮荧光；同时，n-cds具有良好的荧光稳定性，即n-cds在室温环境长期放置、紫外照射数小时等条件处理几乎不会影响n-cds的荧光强度。此外，当合成n-cds采用的碳源及所用的合成方法改变时，n-cds所获得的含氧官能团及尺寸也会相应改变。由于不同的含氧官能团可与特定场合的表面结构反应，以碳源为例，以艾草为碳源合成的氮掺杂碳量子点(n-cds)可与细菌表面结合并反应；以酵母浸膏粉等前体合成的氮磷掺杂碳量子点(np-cds)因所含官能团导致其可与活细菌产生静电排斥作用无法与活细菌结合。此外，n-cds尺寸较小，不仅易被细胞捕获，通过光子激发实现细胞成像，还可以在不干扰强的组织自发荧光情况下，深入细胞和各种生物屏障，实现探测小型生物结构和细胞成像。目前，n-cds荧光探针仅应用于生物成像领域。然而，在生物成像领域中，荧光探针n-cds对细菌染色时，主要探究荧光探针n-cds对菌体的毒性，导致目前使用该荧光探针染色细菌需时较长，例如荧光探针与细菌共同孵育2h后测定；对荧光探针n-cds与细菌的结合情况及其染色细菌后流式细胞仪检测结果准确性及活菌死菌分布则尚无探究，也尚未见n-cds与荧光染料组合成为细菌活性检测试剂盒，且未见其与流式细胞仪结合应用的报道。
4、目前针对细菌活性检测的相关专利如下：
5、中国专利文献cn107271410a公开了一种细菌或真菌的活性快速检测方法，该专利提出了一种利用荧光分子印迹聚合物即靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体，与细菌或真菌结合测定荧光值快速初步检测细菌或真菌数量的方法，但该方法所需荧光分子印迹聚合物制备较为复杂、且荧光分子印迹聚合物与细菌或真菌为特异性识别与结合，因此对不同细菌活性进行测定时，需重新根据靶细菌制备荧光分子印迹聚合物，无法通用于所有细菌。
6、中国专利文献cn102967545a公开了一种检测活性细菌含量的方法，该专利提出了一种利用ctc染料与待测液体样本共孵育，通过流式细胞仪检测活性病原菌的方法。该方法可准确、快速检测样本中活细菌数量，但无法检测样本中死细菌含量，无法判断死亡细菌或其产物对样本的影响。
7、中国专利文献cn108603881a公开了一种检测生物样品中细菌活性的方法与相应的检测单元，该专利提出了一种利用微型气相色谱仪通过检测细菌代谢产生无机气态物质的含量检测细菌活性的方法，该方法无法检测代谢较弱及死亡细菌的数量。
8、中国专利文献cn114047241a公开了一种细菌活性电化学检测方法，该专利提出了一种通过水浴加热促进菌体内电活性物质释放，运用电化学方法检测细菌活性的方法。但该方法对低活性细菌响应较低、无法检测死亡细菌的数量。
9、目前针对细菌活性检测虽已有相关专利，但专利中所述方法依赖于菌体胞内相关酶的催化作用及相应的化学发光技术及其它辅助设备，无法计算样品中活菌与死菌数目或比例；此外，现有专利中，均未曾涉及荧光探针n-cds结合荧光染料在细菌活性检测领域的应用。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒及其检测方法。特别是提供了一种活菌荧光探针n-cds、死菌荧光染料pi结合流式细胞仪进行活菌和死菌状态及含量的检测方法。旨在克服传统微生物活性检测方法无法检测微生物的存活情况，传统荧光染料对微生物的染色效果受菌体影响较大等问题，基于地衣芽孢杆菌制备可对微生物成像且对微生物结构完整性无影响的n-cds，建立一种流式细胞仪与荧光探针n-cds和死菌荧光染料pi相结合，准确、快速的微生物活性鉴定方法，该方法测定结果重复性好、灵敏度高，可用于科研实验室对新型抑菌物质的评价及临床实验室开展微生物感染相关的检测。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒，包括氮掺杂碳量子点荧光探针(n-cds)和荧光染料碘化丙啶(pi)。
4、根据本专利技术优选的，所述氮掺杂碳量子点荧光探针是以地衣芽孢杆菌为前体合成的氮掺杂碳量子点荧光探针(n-cds)。
5、进一步优选的，所述氮掺杂碳量子点荧光探针的制备方法如下：
6、a)将地衣芽孢杆菌接种至lb液体培养基中，培养并收集活化后菌悬液；然后将活化后菌悬液接种至lb液体培养基中，在37℃、150～180rpm下培养12～24h，再本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒，其特征在于，包括氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)和荧光染料碘化丙啶(PI)；
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氮掺杂碳量子点荧光探针的制备方法如下：
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤a)中，所述地衣芽孢杆菌和LB液体培养基体积比为(1～4)：(500～2000)；所述活化后菌悬液和LB液体培养基的体积比为(1～4)：(500～2000)。
4.一种利用权利要求1所述试剂盒检测微生物活性的方法，其特征在于，包括步骤如下：
5.如权利要求4所述检测微生物活性的方法，其特征在于，所述待检测菌为真菌或细菌；
6.如权利要求4所述检测微生物活性的方法，其特征在于，所述流式细胞仪在检测前进行区域门圈定及补偿调节参数设置，具体如下：
7.如权利要求4所述检测微生物活性的方法，其特征在于，所述第一次共孵育为：在20～40℃条件下共孵育30～120min；所述第二次共孵育为：在20～40℃、避光条件下共孵育10～30min；
9.如权利要求4所述检测微生物活性的方法，其特征在于，所述流式细胞仪检测时，紫外激光器激发的蓝色通道检测被氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)结合的活菌显示绿色荧光；氩离子激光器激发的FL3通道检测被荧光染料碘化丙啶(PI)结合的死菌显示红色荧光。
10.如权利要求4所述检测微生物活性的方法，其特征在于，在第一次共孵育和第二次共孵育完成后，向待检测体系中添加细菌计数微球，根据流式细胞仪检测结果，计算得到待检测菌的活菌与死菌的绝对数量。
...【技术特征摘要】
1.一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒，其特征在于，包括氮掺杂碳量子点荧光探针(n-cds)和荧光染料碘化丙啶(pi)；
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氮掺杂碳量子点荧光探针的制备方法如下：
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤a)中，所述地衣芽孢杆菌和lb液体培养基体积比为(1～4)：(500～2000)；所述活化后菌悬液和lb液体培养基的体积比为(1～4)：(500～2000)。
4.一种利用权利要求1所述试剂盒检测微生物活性的方法，其特征在于，包括步骤如下：
5.如权利要求4所述检测微生物活性的方法，其特征在于，所述待检测菌为真菌或细菌；
6.如权利要求4所述检测微生物活性的方法，其特征在于，所述流式细胞仪在检测前进行区域门圈定及补偿调节参数设置，具体如下：
7.如权利要求4所述检测微生物活...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱翎嘉，张东春，张绍明，
申请(专利权)人：山东省大健康精准医疗产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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