【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种聚对苯二甲酸乙二醇酯聚酯水解酶突变体及其应用，属于生物。
技术介绍
1、随着经济高速发展，人们对塑料制品的消耗水平显著提升，全球每年塑料消耗量超3.2亿吨，并以每年4-6％的速度增长。塑料废弃物因其难以降解，在环境中持续积累，对生态构成严重威胁。聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)因其优越的耐用性和可塑性，在食品、药品、饮料等包装领域应用广泛。塑料垃圾中约60％为pet制品，以工业和生活固体垃圾为主，是“白色污染”的主要来源。
2、pet废弃物的传统处理方法是焚烧法和填埋法。其中焚烧法是处理pet最直接，最快速的方法，然而，焚烧产生的大量有毒气体(如二恶英、一氧化碳等)会对大气造成更严重的破坏。填埋法虽然不会对大气造成严重危害，但是填埋会占用大量的土地资源，甚至对地下水资源造成严重的污染。生物酶法降解pet塑料，因其环境友好性以及可持续性，近年来受到日益广泛的关注。
3、pet聚酯水解酶是一种针对pet聚酯有着高专一性的酶，其主要来自羧酸酯水解酶(ec 3.1.1)，具体包括：脂肪酶(ec 3.1.1.3)，角质酶(ec 3.1.1.74)，pet酶(ec3.1.1.101)和mhet酶(ec 3.1.1.102)。pet聚酯水解酶可以在较为温和的条件下降pet聚酯水解为单羟乙基对苯二甲酸酯(mono(2-hydroxyethyl)terephthalate-mhet)，对苯二甲酸(terephthalic acid-tpa)和乙二醇(ethylene glycol-eg)，因此利用pet聚酯
技术实现思路
1、本专利技术聚焦于pet降解过程中由于主要水解产物(tpa和mhet)的积累造成的ph值变化，提供一种通过ph敏感荧光探针进行pet聚酯塑料水解酶高通量筛选的方案。
2、本专利技术提供了一种聚对苯二甲酸乙二醇酯聚酯水解酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的聚对苯二甲酸乙二醇酯酯水解酶的第233位的天冬酰胺突变为半胱氨酸，第282位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第214位的组氨酸突变为丝氨酸，第245位的丝氨酸突变为精氨酸，同时，将第89位的丙氨酸突变为苏氨酸，第90位的精氨酸突变为苏氨酸得到的；命名为：durapetase-4m-a89s/r90t；
3、本专利技术还提供了一种聚对苯二甲酸乙二醇酯聚酯水解酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的苯二甲酸乙二醇酯聚酯水解酶的第233位的天冬酰胺突变为半胱氨酸，第282位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第214位的组氨酸突变为丝氨酸，第245位的丝氨酸突变为精氨酸，同时，将第89位的丙氨酸突变为脯氨酸，第90位的精氨酸突变为脯氨酸，第92位的丝氨酸突变为赖氨酸得到的，命名为：durapetase-4m-a89p/r90p/s92k。
4、在本专利技术的一种实施方式中，编码所述聚对苯二甲酸乙二醇酯酯水解酶亲本酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、本专利技术还提供了编码上述突变体的基因。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体durapetase-4m-a89s/r90t的氨基酸序列如seq id no.3所示。
7、在本专利技术的一种实施方式中，编码所述突变体durapetase-4m-a89s/r90t的核苷酸序列如seq id no.4所示。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体durapetase-4m-a89p/r90p/s92k的氨基酸序列如seq id no.5所示。
9、在本专利技术的一种实施方式中，编码所述突变体durapetase-4m-a89p/r90p/s92k的核苷酸序列如seq id no.6所示。
10、本专利技术还提供了携带上述基因的载体。
11、本专利技术还提供了携带上述基因或上述载体的重组细胞。
12、在本专利技术的一种实施方式中，以细菌或真菌为宿主细胞。
13、本专利技术还提供了一种含有上述突变体的产品。
14、在本专利技术的一种实施方式中，所述产品为化学品。
15、本专利技术还提供了一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯或含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的物质的方法，所述方法为，向含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的体系中加入上述突变体、或上述重组细胞、或采用上述重组细胞表达的酶进行反应。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的物质包括但不限于以下一种或者多种物质：goodfellow无定型pet塑料颗粒，goodfellow无定型塑料薄膜，商业化pet粉末(科信达公司)。
17、在本专利技术的一种实施方式中，上述反应在30～50℃，ph 5.0～9.0条件下进行反应。
18、本专利技术还提供了具有pet聚酯塑料降解能力的筛选制备方法，所述方法包括以下步骤：
19、(1)利用ph敏感的荧光探针作为荧光筛选标记进行高通量筛选。
20、(2)筛选对象包括但不限于具有pet聚酯塑料降解能力的脂肪酶、角质酶、pet酶、mhet酶的一种或几种。
21、(3)ph敏感荧光探针包括但不限于终浓度10μm的5(6)-羧基荧光素，ph敏感aza-bodipy染料，ph敏感罗丹明110染料，比率型ph-750荧光染料，ph敏感o-甲基丙烯酸酯荧光素(fluorescein o-methacrylate)。
22、本专利技术还提供了上述聚对苯二甲酸乙二醇酯聚酯水解酶突变体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
23、(1)突变文库的建立：所述的五个氨基酸位点分别为：t88，a89，r90，q91以及s92，针对该位点设计饱和突变引物；通过pcr反应得到含有pet降解酶突变文库的菌株；
24、(2)将含有pet降解酶突变文库的菌株进行培养后，分别得到含有pet降解酶突变文库的粗酶液；
25、(3)利用高通量排枪向灭菌96深孔板中添加ph 9.0的甘氨酸-naoh缓冲液以及步骤(2)得到的粗酶液，同时向孔板中添加pet颗粒底物；于高通量摇床上进行反应；反应结束后，向反应液中添加5(6)-羧基荧光素，混匀后得到反应液；随后使用高通量排枪吸取含有5(6)-羧基荧光素的反应液于96孔荧光显色板中进行荧光强度测定，荧光强度越低，说明ph值越低，表明降解效果越佳；
26、(4)挑取荧光强度显著降低的突变体菌株进行培养，得到粗酶液；通过sds-page凝胶电泳观察突变体蛋白表达情况，使用等目的蛋白量的粗酶液进行pet降解实验，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种聚对苯二甲酸乙二醇酯聚酯水解酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的聚对苯二甲酸乙二醇酯酯水解酶的第233位的天冬酰胺突变为半胱氨酸，第282位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第214位的组氨酸突变为丝氨酸，第245位的丝氨酸突变为精氨酸，同时，将第89位的丙氨酸突变为丝氨酸，第90位的精氨酸突变为苏氨酸得到的；
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述载体的重组细胞。
5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，以细菌或真菌为宿主细胞。
6.一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯或含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的化学品，其特征在于，所述化学品中含有权利要求1所述的突变体。
7.一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯或含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的物质的方法，其特征在于，向含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的体系中加入权利要求1所述突变体或权利要求4或5所述的重组细胞进行反应。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在30
9.权利要求1所述的高效聚对苯二甲酸乙二醇酯聚酯水解酶突变体的获取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
10.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的载体，或权利要求4或5所述的重组细胞在制备含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种聚对苯二甲酸乙二醇酯聚酯水解酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的聚对苯二甲酸乙二醇酯酯水解酶的第233位的天冬酰胺突变为半胱氨酸，第282位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第214位的组氨酸突变为丝氨酸，第245位的丝氨酸突变为精氨酸，同时，将第89位的丙氨酸突变为丝氨酸，第90位的精氨酸突变为苏氨酸得到的；
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述载体的重组细胞。
5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，以细菌或真菌为宿主细胞。
6.一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯或含有聚对苯二...
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