【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开文本提供了使用柱色谱选择、刺激并工程化样品中的细胞，并且在不使用用于促进所述细胞从所述柱脱附的另外的步骤或试剂的情况下从所述柱收集和/或洗脱所述细胞的方法。在一些方面，与现有方法相比，本文提供的方法缩短了生成最终用于细胞疗法的经选择、刺激并工程化的细胞的群体所需的时间。还提供了制品及其设备。
技术介绍
1、多种细胞疗法方法可用于治疗疾病和病症。细胞疗法方法包括涉及免疫细胞如t细胞(例如，cd4+和cd8+t细胞)的方法，所述免疫细胞可以用重组受体如嵌合抗原受体基因工程化。需要用于生成适用于例如细胞疗法中的细胞群体的改进的方法。本文提供了满足此类需求的方法、制品和设备。
技术实现思路
1、在一些实施方案中，本文提供了一种柱上转导t细胞的方法，所述方法包括：(a)使多个t细胞同时与t细胞刺激试剂和包含编码重组蛋白的核酸序列的病毒载体接触，其中所述多个t细胞被固定在包含于色谱柱的内部空腔中的固定相上；(b)在所述t细胞刺激试剂和所述病毒载体的存在下孵育所述多个t细胞；以及(c)在所述接触的24小时内，从所述色谱柱收集所述多个t细胞，从而产生包含用所述重组蛋白转导的t细胞的组合物。
2、在任何实施方案中的一些中，所述固定相包含与所述多个t细胞的表面上表达的选择标记特异性结合的选择剂，其中所述选择剂与所述选择标记的特异性结合实现将所述多个t细胞固定在所述固定相上。
3、在一些实施方案中，本文还提供了一种柱上转导t细胞的方法，所述方法包括：(a)将包含多个t细胞的
4、在任何实施方案中的一些中，所述刺激试剂和所述病毒载体作为单独的组合物与所述多个t细胞接触。在任何实施方案中的一些中，所述刺激试剂和所述病毒载体作为同一组合物中的混合物与所述多个t细胞接触。
5、在一些实施方案中，本文还提供了一种柱上转导t细胞的方法，所述方法包括：(a)制备包含t细胞刺激试剂和病毒载体制剂的混合物；(b)使多个t细胞与所述混合物在色谱柱上接触，其中所述多个t细胞被固定在包含于所述色谱柱的内部空腔中的固定相上；(c)在所述t细胞刺激试剂和所述病毒载体的存在下孵育所述多个t细胞；以及(d)在所述接触的24小时内，从所述色谱柱收集所述多个t细胞，从而产生包含用所述重组蛋白转导的t细胞的组合物。
6、在任何实施方案中的一些中，所述固定相包含与所述多个t细胞的表面上表达的选择标记特异性结合的选择剂，其中所述选择剂与所述选择标记的特异性结合实现将所述多个t细胞固定在所述固定相上。
7、在一些实施方案中，本文还提供了一种柱上转导t细胞的方法，所述方法包括：(a)将包含多个t细胞的样品添加至色谱柱的内部空腔，其中所述内部空腔包含含有选择剂的固定相，所述选择剂与所述多个t细胞的表面上表达的选择标记特异性结合，从而将所述多个t细胞固定在所述固定相上；(b)通过向所述色谱柱的内部空腔中添加包含t细胞刺激剂(例如，刺激试剂)和含有编码重组蛋白的核酸序列的病毒载体的混合物，使所述多个t细胞与所述t细胞刺激试剂和所述病毒载体接触；(c)在所述t细胞刺激试剂和所述病毒载体的存在下孵育所述多个t细胞；以及(d)在添加所述混合物的24小时内，从所述色谱柱收集所述多个t细胞，从而产生包含用所述重组蛋白转导的t细胞的组合物。
8、在任何实施方案中的一些中，所述方法包括使所述刺激试剂和所述病毒载体混合以形成包含所述刺激试剂和所述重组核酸分子(例如，所述病毒载体)的混合物。
9、在任何实施方案中的一些中，所述接触在将所述样品添加至所述内部空腔之后在或在约10分钟内、在或在约20分钟内、在或在约30分钟内、在或在约45分钟内、在或在约60分钟内、在或在约90分钟内、或在或在约120分钟内开始。在任何实施方案中的一些中，所述接触在将所述样品添加至所述内部空腔之后在或在约60分钟内开始。
10、在任何实施方案中的一些中，所述孵育的至少一部分在约35℃与约39℃之间的温度进行。在任何实施方案中的一些中，所述孵育的至少一部分在为或约37℃的温度进行。
11、在任何实施方案中的一些中，所述固定相的温度由一个或多个加热元件调节，所述一个或多个加热元件配置为向所述固定相提供热量。
12、在任何实施方案中的一些中，使所述t细胞刺激剂(例如，刺激试剂)和病毒载体在无血清培养基中与所述多个t细胞接触，并且其中所述孵育(incubation)(例如，所述孵育(incubating))在无血清培养基中进行。在任何实施方案中的一些中，所述无血清培养基包含一种或多种重组t细胞刺激细胞因子。
13、在任何实施方案中的一些中，使所述t细胞刺激剂(例如，刺激试剂)和病毒载体在包含一种或多种重组t细胞刺激细胞因子的培养基中与所述多个t细胞接触。
14、在任何实施方案中的一些中，所述混合物是包含一种或多种重组t细胞刺激细胞因子的培养基。
15、在任何实施方案中的一些中，所述培养基是无血清培养基。
16、在任何实施方案中的一些中，所述一种或多种重组细胞因子选自il-2、il-15和il-7。在任何实施方案中的一些中，所述一种或多种重组细胞因子是il-2、il-15和il-7。
17、在任何实施方案中的一些中，使所述t细胞刺激剂(例如，刺激试剂)以如下量与所述多个t细胞接触：在或在约0.1μg与20μg之间包含端值、在或在约0.4μg与8μg之间包含端值、或在或在约0.8μg与4μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞。在任何实施方案中的一些中，使所述t细胞刺激剂(例如，刺激试剂)以如下量与所述多个t细胞接触：在或在约1μg与2μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞。
18、在任何实施方案中的一些中，所述混合物包含如下量的所述t细胞刺激剂(例如，刺激试剂)：在或在约0.1μg与20μg之间包含端值、在或在约0.4μg与8μg之间包含端值、或在或在约0.8μg与4μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞。在任何实施方案中的一些中，所述混合物包含如下量的所述t细胞刺激剂(例如，刺激试剂)：在或在约1μg与2μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种柱上转导T细胞的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定相包含与所述多个T细胞的表面上表达的选择标记特异性结合的选择剂，其中所述选择剂与所述选择标记的特异性结合实现将所述多个T细胞固定在所述固定相上。
3.一种柱上转导T细胞的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述T细胞刺激试剂和所述病毒载体作为单独的组合物与所述多个T细胞接触。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述T细胞刺激试剂和所述病毒载体作为同一组合物中的混合物与所述多个T细胞接触。
6.一种柱上转导T细胞的方法，所述方法包括：
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述固定相包含与所述多个T细胞的表面上表达的选择标记特异性结合的选择剂，其中所述选择剂与所述选择标记的特异性结合实现将所述多个T细胞固定在所述固定相上。
8.一种柱上转导T细胞的方法，所述方法包括：
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述方法包括混合所述T细胞刺激试剂和所述病毒载体
10.根据权利要求3-5、8和9中任一项所述的方法，其中所述接触在将所述样品添加至所述内部空腔之后在或在约10分钟内、在或在约20分钟内、在或在约30分钟内、在或在约45分钟内、在或在约60分钟内、在或在约90分钟内、或在或在约120分钟内开始。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述孵育的至少一部分在约35℃与约39℃之间的温度进行。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述孵育的至少一部分在为或约37℃的温度进行。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述固定相的温度由一个或多个加热元件调节，所述一个或多个加热元件配置为向所述固定相提供热量。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中使所述T细胞刺激试剂和所述病毒载体在无血清培养基中与所述多个T细胞接触，并且其中所述孵育在无血清培养基中进行。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述无血清培养基包含一种或多种重组T细胞刺激细胞因子。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述T细胞刺激试剂和所述病毒载体在包含一种或多种重组T细胞刺激细胞因子的培养基中与所述多个T细胞接触。
17.根据权利要求6-16中任一项所述的方法，其中所述混合物是包含一种或多种重组T细胞刺激细胞因子的培养基。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述培养基是无血清培养基。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子选自IL-2、IL-15和IL-7。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子是IL-2、IL-15和IL-7。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中使所述T细胞刺激试剂以如下量与所述多个T细胞接触：在或在约0.1μg与20μg之间包含端值、在或在约0.4μg与8μg之间包含端值、或在或在约0.8μg与4μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个T细胞或固定在所述固定相上的估计的多个T细胞中的106个细胞。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中使所述T细胞刺激试剂以如下量与所述多个T细胞接触：在或在约1μg与2μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个T细胞或固定在所述固定相上的估计的多个T细胞中的106个细胞。
23.根据权利要求6-23中任一项所述的方法，其中所述混合物包含如下量的所述T细胞刺激试剂：在或在约0.1μg与20μg之间包含端值、在或在约0.4μg与8μg之间包含端值、或在或在约0.8μg与4μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个T细胞或固定在所述固定相上的估计的多个T细胞中的106个细胞。
24.根据权利要求6-23中任一项所述的方法，其中所述混合物包含如下量的所述T细胞刺激试剂：在或在约1μg与2μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个T细胞或固定在所述固定相上的估计的多个T细胞中的106个细胞。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中使所述病毒载体以如下体积与所述多个T细胞接触：在或在约0.1μL与100μL之间包含端值、在或在约0.5μL与50μL之间包含端值、或在或在约1μL与25μL之间包含端值的所述病毒载体的制剂/固定在所述固定相上的多个T细...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种柱上转导t细胞的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定相包含与所述多个t细胞的表面上表达的选择标记特异性结合的选择剂，其中所述选择剂与所述选择标记的特异性结合实现将所述多个t细胞固定在所述固定相上。
3.一种柱上转导t细胞的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述t细胞刺激试剂和所述病毒载体作为单独的组合物与所述多个t细胞接触。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述t细胞刺激试剂和所述病毒载体作为同一组合物中的混合物与所述多个t细胞接触。
6.一种柱上转导t细胞的方法，所述方法包括：
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述固定相包含与所述多个t细胞的表面上表达的选择标记特异性结合的选择剂，其中所述选择剂与所述选择标记的特异性结合实现将所述多个t细胞固定在所述固定相上。
8.一种柱上转导t细胞的方法，所述方法包括：
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述方法包括混合所述t细胞刺激试剂和所述病毒载体以形成包含所述t细胞刺激试剂和所述病毒载体的混合物。
10.根据权利要求3-5、8和9中任一项所述的方法，其中所述接触在将所述样品添加至所述内部空腔之后在或在约10分钟内、在或在约20分钟内、在或在约30分钟内、在或在约45分钟内、在或在约60分钟内、在或在约90分钟内、或在或在约120分钟内开始。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述孵育的至少一部分在约35℃与约39℃之间的温度进行。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述孵育的至少一部分在为或约37℃的温度进行。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述固定相的温度由一个或多个加热元件调节，所述一个或多个加热元件配置为向所述固定相提供热量。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中使所述t细胞刺激试剂和所述病毒载体在无血清培养基中与所述多个t细胞接触，并且其中所述孵育在无血清培养基中进行。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述无血清培养基包含一种或多种重组t细胞刺激细胞因子。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述t细胞刺激试剂和所述病毒载体在包含一种或多种重组t细胞刺激细胞因子的培养基中与所述多个t细胞接触。
17.根据权利要求6-16中任一项所述的方法，其中所述混合物是包含一种或多种重组t细胞刺激细胞因子的培养基。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述培养基是无血清培养基。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子选自il-2、il-15和il-7。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子是il-2、il-15和il-7。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中使所述t细胞刺激试剂以如下量与所述多个t细胞接触：在或在约0.1μg与20μg之间包含端值、在或在约0.4μg与8μg之间包含端值、或在或在约0.8μg与4μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中使所述t细胞刺激试剂以如下量与所述多个t细胞接触：在或在约1μg与2μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞。
23.根据权利要求6-23中任一项所述的方法，其中所述混合物包含如下量的所述t细胞刺激试剂：在或在约0.1μg与20μg之间包含端值、在或在约0.4μg与8μg之间包含端值、或在或在约0.8μg与4μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞。
24.根据权利要求6-23中任一项所述的方法，其中所述混合物包含如下量的所述t细胞刺激试剂：在或在约1μg与2μg之间包含端值/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中使所述病毒载体以如下体积与所述多个t细胞接触：在或在约0.1μl与100μl之间包含端值、在或在约0.5μl与50μl之间包含端值、或在或在约1μl与25μl之间包含端值的所述病毒载体的制剂/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中使所述病毒载体以如下体积与所述多个t细胞接触：在或在约2μl与10μl之间包含端值的所述病毒载体的制剂/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞，任选地，体积为或约6μl的所述病毒载体的制剂/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞。
27.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述混合物包含体积为在或在约0.1μl与100μl之间包含端值、在或在约0.5μl与50μl之间包含端值、或在或在约1μl与25μl之间包含端值的所述病毒载体的制剂/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞。
28.根据权利要求6-27中任一项所述的方法，其中所述混合物包含体积为在或在约2μl与10μl之间包含端值的病毒载体制剂/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞，任选地，体积为或约6ul的所述病毒载体的制剂/固定在所述固定相上的多个t细胞或固定在所述固定相上的估计的多个t细胞中的106个细胞。
29.根据权利要求6、7和9-28中任一项所述的方法，其中所述病毒载体的制剂具有在或在约1x 106tu/ml与1x 109tu/ml之间、在或在约1x 106tu/ml与1x 108tu/ml之间、在或在约1x 106tu/ml与1x 107tu/ml之间、在或在约1x 107tu/ml与1x 109tu/ml之间、在或在约1x107tu/ml与1x 108tu/ml之间、或在或在约1x 108tu/ml与1x 109tu/ml之间的滴度。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，在所述接触之后不超过22小时、20小时、18小时、16小时、16小时、14小时、12小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时或5小时内进行所述收集。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中在所述接触之后在或在约2小时与24小时、2小时与22小时、2小时与20小时、2小时与18小时、2小时与16小时、2小时与14小时、2小时与12小时、2小时与10小时、2小时与9小时、2小时与8小时、2小时与7小时、2小时与6小时、2小时与5小时、3小时与6小时、3小时与5小时、4小时与6小时、或4小时与5小时之间进行所述收集，每个都包含端值。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中在所述接触之后为或约4.5小时进行所述收集。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中在所述t细胞刺激试剂的存在下进行的孵育从所述固定相释放多个固定的t细胞中的一个或多个。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述收集包括将洗涤缓冲液添加至所述柱，以收集在所述孵育期间从固定至所述固定相释放的所述一个或多个细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述洗涤缓冲液是细胞培养基。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述细胞培养基包含一种或多种重组t细胞刺激细胞因子，任选地其中所述重组t细胞刺激细胞因子选自il-2、il-15和il-7。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述细胞培养基是无血清培养基。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基不包含用于从所述固定相洗脱所述t细胞的竞争剂。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述收集不包括向所述固定相中添加包含用于从所述固定相洗脱所述多个t细胞的竞争剂的介质。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中包含用所述重组蛋白转导的t细胞的组合物不包含竞争剂。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述竞争剂包括生物素或生物素类似物，任选地其中所述生物素类似物是脱硫生物素。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述竞争剂包括d-生物素。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，所述方法包括在溶液中进一步孵育包含转导的t细胞的组合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述进一步孵育在为或约37℃±2℃的温度进行。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中所述进一步孵育进行如下时间：不超过14天、不超过12天、不超过10天、不超过8天、不超过6天或不超过5天。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述进一步孵育在诱导转导的t细胞扩增的条件下进行，任选地其中所述进一步孵育在包含一种或多种重组t细胞刺激细胞因子的细胞培养基中进行，任选地其中所述重组t细胞刺激细胞因子选自il-2、il-15和il-7。
47.根据权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述进一步孵育在其中转导的t细胞的进一步扩增最少或没有进一步扩增的条件下进行。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述进一步孵育在没有任何重组t细胞刺激细胞因子的基础培养基中进行。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述t细胞刺激试剂包含一种或多种能够向t细胞递送刺激信号的刺激剂。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂中的至少一种能够将初级激活信号递送至t细胞，任选地递送通过t细胞的tcr/cd3复合物、t细胞的含cd3复合物和/或t细胞的含itam分子的刺激信号。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种刺激剂是第一刺激剂，并且所述刺激试剂还包括能够增强由所述第一刺激剂递送的刺激信号的第二刺激剂。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述第二刺激剂结合t细胞的共刺激分子。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述共刺激分子选自cd28、cd90(thy-1)、cd95(apo-/fas)、cd137(4-1bb)、cd154(cd40l)、icos、lat、cd27、ox40和hvem。
54.根据权利要求52或权利要求53所述的方法，其中所述第二刺激剂结合cd28。
55.根据权利要求51-54中任一...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·P·波尔托拉克，S·弗雷斯勒，M·埃芬伯格，
申请(专利权)人：朱诺治疗学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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