条件性地表达重组受体的工程化T细胞、相关多核苷酸和方法技术

提供了含有编码重组受体或其一部分的经修饰的T细胞刺激相关基因座的工程化T细胞。在一些方面，编码所述重组受体或其一部分的核酸序列可操作地连接至所述T细胞刺激相关基因座的内源转录调节元件，所述T细胞刺激相关基因座在一些情况下通过靶向整合进行工程化。在一些方面，所述工程化细胞条件性地表达所述重组受体，如在T细胞中刺激或激活信号后。还公开了细胞组合物、用于将细胞工程化的核酸、以及用于产生所述工程化细胞的方法和制品。在一些实施方案中，可以将所述工程化细胞与细胞疗法结合使用，包括与包含所述工程化细胞的过继转移的癌症免疫疗法结合使用。的癌症免疫疗法结合使用。的癌症免疫疗法结合使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】条件性地表达重组受体的工程化T细胞、相关多核苷酸和方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年6月26日提交的标题为“条件性地表达重组受体的工程化T细胞、相关多核苷酸和方法”(“ENGINEERED T CELLS CONDITIONALLY EXPRESSING A RECOMBINANT RECEPTOR,RELATED POLYNUCLEOTIDES AND METHODS”)的美国临时申请号63/044,984的优先权，将其内容通过引用以其整体并入。通过引用并入序列表
[0002]本申请连同电子格式的序列列表一起提交。序列表以2021年6月23日创建、大小为220千字节的名为735042013840SeqList.txt的文件提供。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。


[0003]本公开文本涉及含有编码重组受体或其一部分的经修饰的T细胞刺激相关基因座的工程化T细胞。在一些方面，编码所述重组受体或其一部分的核酸序列可操作地连接至所述T细胞刺激相关基因座的内源转录调节元件，其在一些情况下通过靶向整合进行工程化。在一些方面，所述工程化细胞条件性地表达所述重组受体，如在T细胞中刺激或激活信号后。还公开了细胞组合物、用于将细胞工程化的核酸、以及用于产生所述工程化细胞的方法和制品。在一些实施方案中，可以将所述工程化细胞与细胞疗法结合使用，包括与包含所述工程化细胞的过继转移的癌症免疫疗法结合使用。

技术介绍

[0004]利用重组受体(如嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体(TCR))识别与疾病相关的抗原的过继细胞疗法代表了用于治疗癌症和其他疾病的有吸引力的治疗方式。需要改善的策略来工程化T细胞以表达重组受体，如用于在过继免疫疗法中，例如在治疗癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病中使用。提供了用于在满足此类需求的方法中使用的方法、细胞、组合物和试剂盒。

技术实现思路

[0005]本文提供了工程化T细胞，其包含含有编码重组受体或其一部分的转基因的经修饰的T细胞刺激相关基因座，其中所述转基因与所述T细胞刺激相关基因座的内源转录调节元件可操作地连接，其中所述内源转录调节元件在T细胞中刺激或激活信号后诱导或上调所述可操作地连接的转基因的表达。
[0006]在任何实施方案的一些实施方案中，所述内源转录调节元件是内源T细胞刺激相关基因座的启动子。在任何实施方案的一些实施方案中，编码所述重组受体或其一部分的转基因存在于所述启动子的下游。
[0007]在任何实施方案的一些实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达是可诱导的，并且在所述细胞中所述刺激或激活信号之后被诱导。在任何实施方案的一些实施方案
中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约6小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约12小时内被上调或诱导。在任何实施方案的一些实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约24小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约36小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约48小时内被上调或诱导。
[0008]在任何实施方案的一些实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达不是永久性的和/或可以随着时间的推移或在不存在所述T细胞的刺激或激活信号的情况下降低。在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后或在所述T细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达被降低或下调。在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后或在所述T细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达被降低或下调大于或大于约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后，在所述T细胞中的所述刺激或激活信号之后为或约1、2、3、4、5、6、7或8天或更长时间之后，所述可操作地连接的转基因的表达被降低或下调。在任何实施方案的一些实施方案中，在所述T细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后小于或小于约6、12、18、24、36或48小时内，所述可操作地连接的转基因的表达被降低或下调。
[0009]在任何实施方案的一些实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达能够在所述T细胞中进一步刺激或激活信号之后再次被诱导或上调。在任何实施方案的一些实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约6、12、18、24、36或48小时内被上调或诱导。在任何实施方案的一些实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达是可诱导的，并且在所述细胞中所述刺激或激活信号之后被诱导。在任何实施方案的一些实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约6小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约12小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约24小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约36小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约48小时内被上调或诱导。
[0010]在任何实施方案的一些实施方案中，在所述T细胞中所述刺激或激活信号之后，来自内源T细胞刺激相关基因座的开放阅读框的翻译产物在所述细胞中不表达，或者所述内
源T细胞刺激相关基因座的功能性内源基因产物不表达。在任何实施方案的一些实施方案中，所述经修饰的T细胞刺激相关基因座包含所述内源T细胞刺激相关基因座的开放阅读框中的缺失、插入、移码突变或无义突变。
[0011]在任何实施方案的一些实施方案中，所述内源T细胞刺激相关基因座选自PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3和HLA
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DR基因座。在任何实施方案的一些实施方案中，所述内源T细胞刺激相关基因座是PDCD1基因座。在一些任何实施方案中，所述内源T细胞刺激相关基因座是CD69基因座。在一些任何实施方案中，所述内源T细胞刺激相关基因座是Nur7本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含经修饰的T细胞刺激相关基因座的工程化T细胞，所述经修饰的T细胞刺激相关基因座包含整合至所述T细胞的内源T细胞刺激相关基因座中的编码重组受体的转基因，其中所述转基因与所述内源T细胞刺激相关基因座的内源转录调节元件可操作地连接，其中所述内源转录调节元件在T所述细胞中的刺激或激活信号之后诱导或上调所述可操作地连接的转基因的表达。2.根据权利要求1所述的工程化T细胞，其中：所述内源转录调节元件是所述内源T细胞刺激相关基因座的启动子，并且编码所述重组受体或其一部分的所述转基因存在于所述启动子的下游。3.根据权利要求1或2所述的工程化T细胞，其中所述内源转录调节元件包含由在所述刺激或激活信号之后被激活的转录因子识别的一个或多个应答元件。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的工程化T细胞，其中所述可操作地连接的转基因的表达在所述T细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约6、12、18、24、36或48小时内被诱导或上调；任选地其中所述可操作地连接的转基因的表达被上调或诱导大于或大于约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因的表达的诱导或上调是在刺激或激活信号期间暂时的，然后被降低或下调。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的工程化T细胞，其中，在表达的所述诱导或上调之后，任选地在所述T细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达被降低或下调。7.根据权利要求6所述的工程化T细胞，其中在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，在所述T细胞中的进一步刺激或激活信号之后，所述可操作地连接的转基因的表达被诱导或上调。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的工程化T细胞，其中所述内源T细胞刺激相关基因座选自PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3和HLA
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DR基因座。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的工程化T细胞，其中所述重组受体包含胞外结合结构域，并且药剂与所述重组受体的胞外结合结构域的结合导致在所述细胞中诱导或传递所述刺激或激活信号。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的工程化T细胞，其中：所述重组受体包含含有所述T细胞受体(TCR)复合物的组分的细胞内信号传导结构域的细胞内区域，并且所述T细胞中的所述刺激或激活信号包含通过存在于所述重组受体中的细胞内信号传导结构域的信号，和/或所述重组受体包含含有细胞内信号传导结构域的细胞内区域，所述细胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，并且所述T细胞中的所述刺激或激活信号包含通过存在于所述重组受体中的细胞内信号传导结构域的信号。11.根据权利要求10所述的工程化T细胞，其中所述细胞内信号传导区域包含CD3链、任选CD3
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zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。12.根据权利要求9
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11中任一项所述的工程化T细胞，其中所述药剂是靶抗原，任选地其中所述靶抗原是重组蛋白或在细胞的表面上表达的抗原。13.根据权利要求12所述的工程化T细胞，其中所述靶抗原是肿瘤抗原、病原体特异性
或病原体表达的抗原、炎性抗原或自身抗原。14.根据权利要求9
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11中任一项所述的工程化T细胞，其中所述药剂是抗独特型抗体。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的工程化T细胞，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因编码所述重组受体或所述重组受体的一部分。17.根据权利要求16所述的工程化T细胞，其中所述重组受体包含两条单独的多肽链，其中由所述转基因编码的所述重组受体的部分是所述重组受体的一条链，并且所述工程化T细胞还包含所述重组受体的另一条链，任选地其中所述重组受体的另一条链由第二转基因编码。18.根据权利要求1
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14、16和17中任一项所述的工程化T细胞，其中所述重组受体是重组T细胞受体(TCR)，任选地其中所述重组TCR包含α(TCRα)链和β(TCRβ)链，并且所述转基因包含编码所述TCRα链的核酸序列和编码所述TCRβ链的核酸序列。19.根据权利要求1
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18中任一项所述的工程化T细胞，其中所述转基因还包含一个或多个多顺反子元件，任选地其中所述一个或多个多顺反子元件包含编码选自T2A、P2A、E2A或F2A的核糖体跳跃元件或内部核糖体进入位点(IRES)的序列。20.根据权利要求19所述的工程化T细胞，其中：所述重组受体是重组TCR，并且所述多顺反子元件定位于编码所述TCRα的核苷酸序列与编码所述TCRβ的核苷酸序列之间；所述重组受体是多链CAR，并且所述多顺反子元件定位于编码所述多链CAR的一条链的核苷酸序列与编码所述多链CAR的另一条链的核苷酸序列之间；和/或所述一个或多个多顺反子元件在编码所述重组受体的核苷酸序列的上游。21.根据权利要求1
‑
20中任一项所述的工程化T细胞，其中所述经修饰的T细胞刺激相关基因座是通过经由以下方式将编码所述重组受体的转基因整合至所述内源T细胞刺激相关基因座中产生的：a)在所述内源T细胞刺激相关基因座处或附近的一个或多个靶位点处诱导基因破坏，任选地其中所述基因破坏是通过特异性结合至、识别或杂交至所述靶位点的锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR
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Cas9组合实现的；以及b)引入用于同源定向修复(HDR)的多核苷酸。22.根据权利要求21所述的工程化T细胞，其中将编码所述重组受体的转基因整合在所述T细胞刺激相关基因座中的至少一个靶位点处或附近。23.根据权利要求1
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22中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞刺激相关基因座是PDCD1，并且其中所述基因破坏是通过包含gRNA的CRISPR
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Cas9组合实现，并且所述gRNA具有与PDCD1基因中的靶位点互补的靶向结构域，任选地其中所述gRNA包含SEQ ID NO:75和104
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109中任一个、任选SEQ ID NO:75所示的序列。24.根据权利要求1
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22中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞刺激相关基因座是CD69，并且其中所述基因破坏是通过包含gRNA的CRISPR
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Cas9组合实现，并且所述gRNA具有与CD69基因中的靶位点互补的靶向结构域，任选地其中所述gRNA包含SEQ ID NO:116
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121中任一个所示的序列。
25.根据权利要求1
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22中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞刺激相关基因座是Nur77，并且其中所述基因破坏是通过包含gRNA的CRISPR
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Cas9组合实现，并且所述gRNA具有与Nur77基因中的靶位点互补的靶向结构域，任选地其中所述gRNA包含SEQ ID NO:122
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127和134
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136所示的序列。26.根据权利要求1
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22中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞刺激相关基因座是FoxP3。27.根据权利要求1
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22中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞刺激相关基因座是HLA
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DR基因座。28.根据权利要求1
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27中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞还包含内源T细胞受体α恒定区(TRAC)基因和/或内源T细胞受体β恒定区(TRBC)基因处的基因破坏，任选地其中所述基因破坏是通过CRISPR
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Cas9组合实现的，并且所述CRISPR
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Cas9组合包含具有与所述TRAC、TRBC1和/或TRBC2基因内的至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导RNA(gRNA)，任选地其中所述CRISPR
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Cas9组合是包含所述gRNA和Cas9蛋白的核糖核蛋白(RNP)复合物，任选地其中所述基因破坏是通过经由电穿孔引入多个T细胞中的RNP实现的。29.根据权利要求28所述的工程化T细胞，其中：所述gRNA具有与TRAC基因中的靶位点互补的靶向结构域，任选地其中所述gRNA包含SEQ ID NO:77和188
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218中任一个、任选SEQ ID NO:77所示的序列；和/或所述gRNA具有与TRBC基因中的靶位点互补的靶向结构域，任选地其中所述gRNA包含SEQ ID NO:219
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276中任一个所示的序列。30.根据权利要求1
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29中任一项所述的工程化T细胞，其中与包含存在于所述T细胞的基因组中的不同位置处或存在于所述T细胞的基因组中的随机位置处的编码相同重组受体的转基因的工程化T细胞相比，在所述T细胞中不存在刺激或激活信号的情况下，通过所述编码的重组受体的细胞内信号传导结构域的信号传导活性降低大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更多。31.根据权利要求1
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30中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞或其亚型。32.根据权利要求1
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31中任一项所述的工程化T细胞，其中所述T细胞是源自受试者的T细胞，任选地其中所述受试者是人。33.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含：(a)编码重组受体或其一部分的转基因，以及(b)与所述转基因连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与T细胞中的内源T细胞刺激相关基因座的一个或多个区域同源的序列。34.根据权利要求33所述的多核苷酸，其中：当所述重组受体由引入了所述多核苷酸的细胞表达时，所述重组受体或其一部分由包含编码所述重组受体或其一部分的转基因的经修饰的T细胞刺激相关基因座编码；和/或所述转基因是对于T细胞、任选人T细胞的内源T细胞刺激相关基因座的开放阅读框而言外源或异源的序列。35.根据权利要求33或34所述的多核苷酸，其中所述一个或多个同源臂包含5'同源臂和/或3'同源臂，任选地其中所述5'同源臂和/或3'同源臂包含与靶位点周围的核酸序列同
源的核酸序列，其中所述靶位点位于所述T细胞刺激相关基因座内。36.根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述靶位点位于所述T细胞刺激相关基因座的内源转录调节元件的下游。37.根据权利要求35或36所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含结构[5'同源臂]
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[转基因]
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[3'同源臂]。38.根据权利要求33
‑
37中任一项所述的多核苷酸，其中所述5'同源臂和所述3'同源臂的长度独立地在为或约50与为或约750个核苷酸之间、为或约50与为或约500个核苷酸之间、为或约50与为或约250个核苷酸之间、为或约50与为或约100个核苷酸之间、为或约100与为或约750个核苷酸之间、为或约100与为或约500个核苷酸之间、为或约100与为或约250个核苷酸之间、为或约250与为或约750个核苷酸、为或约250与为或约500个核苷酸之间；独立地是为或约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400或500个核苷酸，或任何前述值之间的任何值；或独立地小于或小于约100个核苷酸，任选地是为或约50、60、70、80或90个核苷酸，或任何前述值之间的任何值。39.根据权利要求33
‑
38中任一项所述的多核苷酸，其中所述T细胞刺激相关基因座选自PDCD1、CD69、Nur77、FoxP3和HLA
‑
DR基因座。40.根据权利要求39所述的多核苷酸，其中所述T细胞刺激相关基因座是PDCD1，任选地其中所述5
’
同源臂和所述3'同源臂包含与PDCD1的一个或多个区域同源的序列。41.根据权利要求40所述的多核苷酸，其中：所述5'同源臂包含：a)含有与SEQ ID NO:66所示的序列展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；b)含有SEQ ID NO:66所示的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；或者c)SEQ ID NO:66所示的序列；和/或所述3'同源臂包含：d)含有与SEQ ID NO:67所示的序列展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；e)含有SEQ ID NO:67所示的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；或f)SEQ ID NO:67所示的序列。42.根据权利要求39所述的多核苷酸，其中所述T细胞刺激相关基因座是CD69，任选地其中所述5
’
同源臂和所述3'同源臂包含与CD69的一个或多个区域同源的序列。43.根据权利要求39所述的多核苷酸，其中所述T细胞刺激相关基因座是Nur77，任选地其中所述5
’
同源臂和所述3'同源臂包含与Nur77的一个或多个区域同源的序列。44.根据权利要求39所述的多核苷酸，其中所述T细胞刺激相关基因座是FoxP3，任选地其中所述5
’
同源臂和所述3'同源臂包含与FoxP3的一个或多个区域同源的序列。45.根据权利要求39所述的多核苷酸，其中所述T细胞刺激相关基因座是HLA
‑
DR基因
座，任选地其中所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与HLA
‑
DR基因座的一个或多个区域同源的序列。46.根据权利要求33
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45中任一项所述的多核苷酸，其中所述重组受体包含胞外结合结构域，并且药剂与所述重组受体的胞外结合结构域的结合导致在所述细胞中诱导或传递所述刺激或激活信号。47.根据权利要求33
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46中任一项所述的多核苷酸，其中：所述重组受体包含含有所述T细胞受体(TCR)复合物的组分的细胞内信号传导结构域的细胞内区域，并且所述T细胞中的所述刺激或激活信号包含通过存在于所述重组受体中的细胞内信号传导结构域的信号，和/或所述重组受体包含含有细胞内信号传导结构域的细胞内区域，所述细胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，并且所述T细胞中的所述刺激或激活信号包含通过存在于所述重组受体中的细胞内信号传导结构域的信号。48.根据权利要求47所述的多核苷酸，其中所述细胞内信号传导区域包含CD3链、任选CD3
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zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。49.根据权利要求46
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48中任一项所述的多核苷酸，其中所述药剂是靶抗原，任选地其中所述靶抗原是重组蛋白或在细胞的表面上表达的抗原。50.根据权利要求49所述的多核苷酸，其中所述靶抗原是肿瘤抗原、病原体特异性或病原体表达的抗原、炎性抗原或自身抗原。51.根据权利要求46
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48中任一项所述的多核苷酸，其中所述药剂是抗独特型抗体。52.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：朱诺治疗学有限公司，
类型：发明
国别省市：