本发明专利技术提供了一种制备磁共振成像仪（ＭＲＩ）可见的、对肝具有靶向性的、核－壳型、可降解纳米基因载体系统的新方法。本发明专利技术基因载体系统的合成与组装包括：１）基因载体系统核的合成；２）基因载体系统壳层的合成；３）核与壳层的组装。本发明专利技术所设计基因载体系统的核层为纳米颗粒，粒径在７０－８５ｎｍ，Ｚｅｔａ电位为正且大于＋１７ｍＶ，由目的基因和可降解聚阳离子组装而成；可降解的壳层带有肝靶向基团和高分子磁共振成像造影剂，比商用小分子造影剂在肝部停留时间长，驰豫率７．７７ｍＭ↑［－１］ｓ↑［－１］，核层与壳层组装体的粒径在９５－１０５ｎｍ，Ｚｅｔａ电位为负，体系储存稳定性和分散性极佳，适合作为体内的基因转染实验载体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术与基因治疗所用载体的设计、合成和组装方法有关，特别是一种制备MRI可见、肝靶向、核-壳型、可降解纳米基因载体的方法。
技术介绍
基因治疗就是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入活体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。载体技术是基因治疗的核心技术，是制约基因治疗能否进入临床的瓶颈。早期，科学家主要以病毒为载体实施疾病的基因治疗，但由于病毒载体的临床安全问题使得非病毒(合成)基因载体在基因治疗中越来越引人注目，然而在非病毒基因载体的研究和应用方面目前还存在以下几方面问题1)由于基因载体表面的Zeta电位为正，导致基因载体进入体内后与血管内壁、血清组分(如血红蛋白)及其他不相关的组织产生非特异性的结合，使基因的投递效率非常低；2)颗粒较大的基因载体会诱导机体产生免疫应答，同时会激活肝脏导致基因载体到达病变细胞或组织之前就在循环系统中被迅速清除；3)基因载体系统缺乏对特定组织、器官或细胞的选择性，在体内不能形成有效的分布，作用于病变组织、器官或细胞的同时，对正常组织、器官或细胞也产生严重的毒副作用；4)基因载体的不可降解性，使其在体内代谢困难，容易产生积累毒性；5)基因载体进入机体后，没有有效的方法来实时监控基因载体在体内的分布情况，目前研究药物最常用的方法是放射性同位素标记法，这种方法需杀死大量的实验动物，实验过程繁琐，研究成本很高。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的就是克服上述缺陷提供一种磁共振成像仪(MRI)可见的、对肝具有靶向性的可降解纳米基因载体系统的制备新方法。实现本专利技术的技术方案如下本专利技术的上述目的是通过新型的“核-壳”结构基因载体系统来实现的，其中，1)载体系统的核由可降解的聚阳离子与目的基因形成的纳米颗粒组成，纳米颗粒的粒径在70-85nm，Zeta电位为正且大于+17mV；2)可降解的壳层带有肝靶向基团和高分子磁共振成像造影剂，在肝部停留时间大于24小时，比商用小分子造影剂在肝部停留时间长，(商用小分子造影剂在肝部停留时间为6小时)，驰豫率7.77mM-1s-1，优于商用小分子造影剂的驰豫率5.95mM-1s-1，Zeta电位为负且小于-10mV； 3)壳层与核层相反的Zeta电位使壳层容易组装在核层的外围，通过调节壳层与核层的比例，可使纳米基因载体系统的Zeta电位为负，避免基因载体进入体内后与血管内壁、血清组分(如血红蛋白)及其他不相关的组织产生非特异性的结合，提高基因的投递效率；4)壳层的肝靶向基团使载体系统对肝具有靶向性，同时使载体系统有较大的水合体积，体系储存稳定性和分散性极佳；5)壳层的磁共振成像造影剂提供了一种用磁共振成像造仪实时监控基因载体在体内分布的有效方法，无须杀死实验动物，实验过程简单，研究成本较低；壳层与核层都是可降解的，不会产生积累毒性；6)壳层与核层的组装体粒径为95-105nm，Zeta电位为负，不会诱导机体产生免疫应答，在循环系统中可长效循环；本专利技术的实施步骤如下1)可降解基因转染试剂的合成及其与目的基因的组装——基因载体系统核的构筑如图1所示，将分子量6000-10000的聚乙烯亚胺(PEI)预聚物和多元丙烯酸酯的醇溶液混合，加入醇钠，常温搅拌反应2-6天，除去低沸点溶剂，纯化，干燥，包装，得基因转染试剂，用核磁共振确定结构并研究其降解性能；所述的多元丙烯酸酯选自1，4-丁二醇双丙烯酯、乙二醇双丙烯酯、丙三醇三丙烯酯、季戊四醇四丙烯酯等，优选用1，4-丁二醇双丙烯酯。用来溶解的醇为甲醇，所述的醇钠可以选用甲醇钠；将上述基因转染试剂与目的基因在缓冲溶液中、无菌条件下组装使其颗粒粒径在70-85nm，Zeta电位为正且大于+17mV，即得基因载体系统的核。a.多元丙烯酸酯的合成称取一定量的多元醇溶于含有机碱的无水非质子溶剂中，低温搅拌下滴加入丙烯酰氯的无水非质子溶剂溶液，搅拌反应4h，过滤，减压蒸馏，收集所需馏分，保存于干燥器中备用。b.可降解基因转染试剂的合成将聚乙烯亚胺(PEI)预聚物的醇溶液和多元丙烯酸酯的醇溶液混合，加入醇钠，常温搅拌反应2-6天，除去低沸点溶剂，纯化，干燥，得可降解基因转染试剂，如图1所示；用核磁确定结构并研究其降解性能。c.可降解基因转染试剂与目的基因的组装——基因载体系统核的构筑将上述可降解基因转染试剂与目的基因在无菌条件下按一定比例混合均匀，震摇15min，使其颗粒粒径在70-85nm，Zeta电位为正且大于+17mV，即得基因载体系统的核层。2)基因载体系统壳层的合成——靶向性高分子造影剂的合成以聚氨基酸为主链，藕连上肝靶向基团的的配体(Gd3+的配体)并使其Zeta电位为负且小于-10mV。在磷酸缓冲溶液中，EDC缩合法将D-乳糖酸或肝导向肽连接到α，β-聚[(2-胺乙基)-L-天冬酰胺上，用定量13C NMR测定糖含量，将二乙三胺五乙酸酐的单活性酯连接到上述载体，用1H NMR确定其结构，动态光散射测定Zeta电位。根据D-乳糖酸或肝导向肽投料量的不同，所得基因载体系统壳层中D-半乳糖残基或肝导向肽残基的摩尔含量为5％-30％。将上述载体与Gd3+络合，用核磁共振确定结构，电感偶合等离子体光谱测定Gd含量，磁共振成像仪测定其弛豫率，并研究其造影增强性能和肝靶向性。3)核与壳层的组装——“核-壳”结构基因载体系统的构筑将上述核与壳层按一定方式混合并孵育一定时间即形成“核-壳”结构基因载体系统。将核与壳层按一定方式混合并孵育一定时间即形成“核-壳”结构基因载体系统。调控核与壳层的比例，使核与壳层组装体纳米颗粒的粒径95-105nm、粒径分布均匀，Zeta电位小于0。用动态光散射测定核与壳层组装体纳米颗粒的粒径、粒径分布及Zeta电位。用动态光散射测定核、核与壳层组装体纳米颗粒的粒径、粒径分布及Zeta电位。本专利技术的方法实验过程简单，研究成本较低；壳层与核层都是可降解的，不会产生积累毒性。制备的基因载体系统壳层的Zeta电位为负且小于-10mV，在肝部停留时间大于24小时，驰豫率高于商用小分子造影剂。由于载体系统的核由可降解的聚阳离子与目的基因形成的纳米颗粒组成，纳米颗粒的粒径在70-85nm，Zeta电位为正且大于+17mV；壳层与核层相反的Zeta电位使壳层容易组装在核层的外围，通过调节壳层与核层的比例，可使纳米基因载体系统的Zeta电位为负，避免基因载体进入体内后与血管内壁、血清组分(如血红蛋白)及其他不相关的组织产生非特异性的结合，提高基因的投递效率；基因载体系统核与壳层组装体的粒径在95-105nm，不会诱导机体产生免疫应答，不会激活肝脏导致基因载体到达病变细胞或组织之前就在循环系统中被迅速清除，在循环系统中可长效循环。基因载体系统对肝部具有选择性，在体内可形成有效的分布，对正常组织、器官或细胞不会产生严重的毒副作用；而且壳层的磁共振成像造影剂提供了一种用磁共振成像造仪实时监控基因载体在体内分布的有效方法，基因载体系统对磁共振成像仪(MRI)可见，基因载体进入机体后，可用MRI实时监控基因载体在体内的分布情况，无须杀死实验动物；可降解的壳层带有肝靶向基团和高分子磁共振成像造影剂，在肝部停留时间大于24小时，比商用小分子造影剂在肝部停留时间长，(商用小本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种磁共振成像仪可见的、对肝具有靶向性的、核－壳型、可降解纳米基因载体系统的制备方法，包括以下步骤：１）、可降解基因转染试剂的合成；２）、可降解基因转染试剂与目的基因组装成基因载体系统的核层；３）、基因载体系统壳层的 合成即靶向性高分子造影剂的合成；４）基因载体系统核与壳层的组装。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余家会，舒婕，彭敏，罗淑芳，刘顺英，俞磊，陈群，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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