【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种手性固定化酶纳米材料及其制备方法与应用。
技术介绍
1、手性是自然界的本质属性之一。手性化合物与其镜像化合物互为对映异构体，虽然两者理化性质基本相同，但空间构型的差异会导致它们在生物活性、代谢途径和代谢产物的毒副作用等方面存在显著差别。天然酶的立体选择低是生物合成工艺研发面临的一大限制因素。利用固定化酶技术改善酶的立体选择性已经取得较多显著的成果。本专利技术以影响酶的三维结构，改变酶活性中心的构象，同时，还可以改变酶分子周围的空间微环境，影响酶的空间位阻，上述因素都有利于提高酶的立体选择性。固定化酶技术可以将酶分子聚集，从而提高体系中的局部酶浓度并构建底物通道来提高中间体的传递速率，提高催化效率。手性固定化酶纳米材料提高酶的立体选择性技术路线优势明显，与游离酶相比具有更高的稳定性和更高的催化效率，催化反应后仍能进行回收分离和重复使用。
2、以甘氨酸和3,4-二羟基苯甲醛为底物，由l-苏氨酸醛缩酶(l-tas)催化合成屈昔多巴。屈昔多巴为抗帕金森症药，临床上主要用于改善由帕金森病引起的步态僵直和直立性头晕。然而，天然l-tas的cβ立体选择性较低，反应过程中产生大量手性副产物，降低了屈昔多巴的手性纯度，为后期的产品提纯造成很大的困难。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种手性固定化酶纳米材料及其制备方法与应用。
2、专利技术思路：l-苏氨酸醛缩酶(l-tas)的活性中心具有极其相似的保守氨基酸
3、为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
4、本专利技术公开了一种手性固定化酶纳米材料的制备方法，将咪唑类化合物与金属盐在手性氨基酸的作用下固定苏氨酸醛缩酶，制得手性固定化酶纳米材料。
5、在一些实施例中，所述咪唑类化合物为2-甲基咪唑、2-巯基咪唑或2-乙基咪唑；所述金属盐为钴盐、锌盐或铜盐；所述手性氨基酸为l-精氨酸、d-精氨酸、l-组氨酸、d-组氨酸或l-苯丙氨酸；所述苏氨酸醛缩酶为l-苏氨酸醛缩酶。
6、在一些实施例中，优选地，所述咪唑类化合物为2-甲基咪唑；所述金属盐为钴盐；所述手性氨基酸为l-精氨酸、l-组氨酸或d-组氨酸，进一步优选为l-精氨酸。
7、其中，所述l-苏氨酸醛缩酶的酶活定义为在40oc、ph＝7的条件下，每分钟产生1μg的屈昔多巴所需要的蛋白量为1u。
8、在一些实施例中，所述钴盐为氯化钴或硝酸钴；所述锌盐为氯化锌或硝酸锌；所述铜盐为氯化铜或硫酸铜。
9、在一些实施例中，优选地，所述钴盐为硝酸钴。
10、在一些实施例中，所述固定的方式为包埋、吸附或配位。
11、具体地，当固定的方式为包埋时，所述手性固定化酶纳米材料的制备方法步骤如下：
12、将咪唑类化合物与金属盐、手性氨基酸、苏氨酸醛缩酶分散于水中进行搅拌，得到悬浊液；将悬浊液离心，去上清液，沉淀用水洗涤，冷冻干燥，即得手性固定化酶纳米材料。
13、在一些实施例中，所述悬浊液中咪唑类化合物的浓度为40～400mmol/l；所述金属盐中的金属离子在悬浊液中的浓度为30～120mmol/l；所述悬浊液中手性氨基酸的浓度为10～50mmol/l；所述悬浊液中苏氨酸醛缩酶的浓度为0.5～2g/l；所述搅拌，搅拌速率为300～500rpm，搅拌时间为30～120min，搅拌温度为室温；所述离心，在4oc、6000rpm条件下离心10min。
14、在一些实施例中，优选地，所述悬浊液中咪唑类化合物的浓度为40～200mmol/l，进一步优选为200mmol/l；所述金属盐中的金属离子在悬浊液中的浓度为45～90mmol/l，进一步优选为60mmol/l；所述悬浊液中手性氨基酸的浓度为10～30mmol/l，进一步优选为10mmol/l；所述悬浊液中苏氨酸醛缩酶的浓度为1g/l；所述搅拌，搅拌速率为300～500rpm，搅拌时间为30～40min，搅拌温度为室温；所述离心，在4oc、6000rpm条件下离心10min。
15、上述的制备方法制备得到的手性固定化酶纳米材料也在本申请的保护范围之内。
16、上述的手性固定化酶纳米材料在催化羟醛缩合反应中的应用也在本申请的保护范围之内。
17、进一步地，本专利技术公开了一种催化剂，包括上述的手性固定化酶纳米材料。
18、更进一步地，本专利技术公开了一种合成屈昔多巴的方法，以上述的手性固定化酶纳米材料或上述的催化剂为催化剂，以3,4-二羟基苯甲醛和甘氨酸为底物，以5’-磷酸吡哆醛为辅酶，催化剂催化底物进行催化反应合成屈昔多巴。
19、具体地，所述手性固定化酶纳米材料的用量为0.5～2g/l；所述3,4-二羟基苯甲醛的用量为10～100mmol/l；所述甘氨酸的用量为0.5～2mol/l；所述5’-磷酸吡哆醛的用量为1～20μmol/l；所述催化反应，反应温度为30～50oc；反应时间为1～8h；所述催化反应，避光进行。
20、具体地，优选地，所述手性固定化酶纳米材料的用量为1g/l；所述3,4-二羟基苯甲醛的用量为50mmol/l；所述甘氨酸的用量为1mol/l；所述5’-磷酸吡哆醛的用量为10μmol/l；所述催化反应，反应温度为40oc；反应时间为2h；所述催化反应，避光进行。
21、其中，优选地，在催化反应过程中，所述手性固定化酶纳米材料分散于去离子水中形成含有手性固定化酶纳米材料的去离子水分散液，所述3,4-二羟基苯甲醛溶于二甲基亚砜中形成含有3,4-二羟基苯甲醛的二甲基亚砜溶液，所述甘氨酸溶于pbs缓冲液(ph＝7，50mm)中形成含有甘氨酸的pbs缓冲溶液，所述5’-磷酸吡哆醛分散于去离子水中形成含有5’-磷酸吡哆醛(plp)的去离子水分散液，将上述的含有手性固定化酶纳米材料的去离子水分散液、含有3,4-二羟基苯甲醛的二甲基亚砜溶液、含有甘氨酸的pbs缓冲溶液、含有5’-磷酸吡哆醛的去离子水分散液混合后进行催化合成屈昔多巴。
22、其中，去离子水、二甲基亚砜、pbs缓冲溶液的用量无特殊限定。
23、有益效果：
24、(1)手性制药是医药行业的前沿领域。此前对于手性化合物主要采用化学合成、化学催化、色谱分离法等方法，但工艺路线复杂、操作费用高、产物易被污染且收率低。本专利技术中制备的手性固定化酶纳米材料可以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种手性固定化酶纳米材料的制备方法，其特征在于，将咪唑类化合物与金属盐在手性氨基酸的作用下固定苏氨酸醛缩酶，制得手性固定化酶纳米材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述咪唑类化合物为2-甲基咪唑、2-巯基咪唑或2-乙基咪唑；所述金属盐为钴盐、锌盐或铜盐；所述手性氨基酸为L-精氨酸、D-精氨酸、L-组氨酸、D-组氨酸或L-苯丙氨酸；所述苏氨酸醛缩酶为L-苏氨酸醛缩酶；所述钴盐为氯化钴或硝酸钴；所述锌盐为氯化锌或硝酸锌；所述铜盐为氯化铜或硫酸铜。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固定的方式为包埋、吸附或配位。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当固定的方式为包埋时，所述手性固定化酶纳米材料的制备方法步骤如下：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述悬浊液中咪唑类化合物的浓度为40～400mmol/L；所述金属盐中的金属离子在悬浊液中的浓度为30～120mmol/L；所述悬浊液中手性氨基酸的浓度为10～50mmol/L；所述悬浊液中苏氨酸醛缩酶的浓度为0.5～2g/L；所述搅
6.权利要求1～5中任意一项所述的制备方法制备得到的手性固定化酶纳米材料。
7.权利要求6所述的手性固定化酶纳米材料在催化羟醛缩合反应中的应用。
8.一种催化剂，其特征在于，包括权利要求6所述的手性固定化酶纳米材料。
9.一种合成屈昔多巴的方法，其特征在于，以权利要求6所述的手性固定化酶纳米材料或权利要求8所述的催化剂为催化剂，以3,4-二羟基苯甲醛和甘氨酸为底物，以5’-磷酸吡哆醛为辅酶，催化剂催化底物进行催化反应合成屈昔多巴。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述手性固定化酶纳米材料的用量为0.5～2g/L；所述3,4-二羟基苯甲醛的用量为10～100mmol/L；所述甘氨酸的用量为0.5～2mol/L；所述5’-磷酸吡哆醛的用量为1～20μmol/L；所述催化反应，反应温度为30～50oC；反应时间为1～8h；所述催化反应，避光进行。
...【技术特征摘要】
1.一种手性固定化酶纳米材料的制备方法，其特征在于，将咪唑类化合物与金属盐在手性氨基酸的作用下固定苏氨酸醛缩酶，制得手性固定化酶纳米材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述咪唑类化合物为2-甲基咪唑、2-巯基咪唑或2-乙基咪唑；所述金属盐为钴盐、锌盐或铜盐；所述手性氨基酸为l-精氨酸、d-精氨酸、l-组氨酸、d-组氨酸或l-苯丙氨酸；所述苏氨酸醛缩酶为l-苏氨酸醛缩酶；所述钴盐为氯化钴或硝酸钴；所述锌盐为氯化锌或硝酸锌；所述铜盐为氯化铜或硫酸铜。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固定的方式为包埋、吸附或配位。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当固定的方式为包埋时，所述手性固定化酶纳米材料的制备方法步骤如下：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述悬浊液中咪唑类化合物的浓度为40～400mmol/l；所述金属盐中的金属离子在悬浊液中的浓度为30～120mmol/l；所述悬浊液中手性氨基酸的浓度为10～50mmol/l；所述悬浊液中苏氨酸醛缩酶的浓度为0.5～...
【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，侯晨馨，陈可泉，储艳，王艺潼，马佳韵，王璐瑶，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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