【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种仿生微肝组织及其制备方法和应用。
技术介绍
1、干细胞在二维培养皿中所诱导分化为的肝细胞样细胞往往成熟度不够，难以发挥正常的肝功能，从而限制了其治疗急性肝衰竭的疗效。多细胞聚集形成的细胞球具有更高的肝向分化潜力，但其尺寸效应鲜有报道，本专利技术通过控制间充质干细胞球的尺寸，实现了高效的肝向细胞分化。此外，血管化也是人造肝组织及时发挥疗效的关键，常规方法直接将血管内皮细胞与分化后的肝细胞样细胞简单混合并不能很好的模拟肝小叶中特定的脉管结构。基于此，本专利技术还利用3d同轴打印血管内皮细胞构建了肝小叶仿生脉管结构，并通过与间充质干细胞球共培养，进一步提高了间充质干细胞肝向分化效率，所构建的血管化微肝组织经皮下移植后，显著促进了急性肝衰竭小鼠的肝再生。
2、间充质干细胞通常在常规的二维培养皿中经诱导培养基分化为肝细胞样细胞，为了提高间充质干细胞的肝向分化效率，其往往被包埋在三维水凝胶中或工程化为多细胞的细胞球以更好地模拟细胞在体内的微环境。此外，通过共培养肝细胞样细胞和血管内皮细胞也可以提高肝细胞功能，其中血管内皮细胞的占比和空间分布是重要的影响因素。肝小叶是肝组织的最小功能单元，具有六边形的连通脉管网络。现有的技术主要通过预设挤出式生物打印或数字光处理使肝细胞和血管内皮细胞相间分布以简单模拟肝小叶的六边形结构。
3、多细胞聚集形成的细胞球相比于相同数量的单细胞细胞虽然具有更高的肝向分化潜能，但由于细胞球大小与其功能高度相关，而现有的技术方案却鲜有关注该尺寸效应，因而疗效缺乏一致
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种仿生微肝组织及其制备方法和应用。本专利技术构建的仿生肝小叶具有六边形连通脉管网络，与间充质干细胞球共培养并诱导其肝向分化，成功制得了具有极性肝衰竭治疗作用的微肝组织。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供一种仿生肝小叶样脉管结构的制备方法，包括：
4、步骤1)分别制备外层支撑墨水和内层牺牲墨水；
5、步骤2)根据预设的中间圆孔、四周呈放射状十二等分的六边形图案，利用所述的外层支撑墨水和内层牺牲墨水进行3d同轴生物打印，获得六边形结构；
6、步骤3)将所述六边形结构置于交联溶液中使外层支撑墨水交联成型，去除内层牺牲墨水，获得仿生肝小叶样脉管结构。
7、本专利技术步骤1)中，所述外层支撑墨水包括血管内皮细胞和如下质量分数的组分：0.1-2％海藻酸钠、1-8％明胶和0.1-10％纤维蛋白原；所述内层牺牲墨水包括1-8％明胶、0.1-2％透明质酸钠和1-100单元/毫升凝血酶。
8、一些具体实施例中，所述外层支撑墨水包括血管内皮细胞、1.5％海藻酸钠、5％明胶和0.1％纤维蛋白原；所述内层牺牲墨水包括7.5％明胶、1.5％透明质酸钠和8单元/毫升凝血酶。
9、本专利技术，步骤2)中，所述打印的条件为：
10、所述支撑墨水和牺牲墨水的挤出气压分别为0.01～0.1mpa、0.1～0.5mpa，温度为15～25℃；所述内层打印的针头直径为0.1～1mm，外层打印的针头直径为0.5～5mm，针头温度均为15～20℃。其中，内层打印针头的直径小于外层打印针头的直径，内外针头温度低于墨水的温度。
11、一些具体实施例中，所述打印的条件为：
12、所述支撑墨水和牺牲墨水的挤出气压分别为0.05mpa、0.35mpa，温度为25℃；所述内层打印的针头直径为0.26mm，外层打印的针头直径为0.8mm，针头温度均为20℃。
13、本专利技术，步骤3)中，所述交联溶液包括40mmol/l氯化钙、0.9wt％氯化钠和8单元/ml凝血酶；所述交联溶液为4℃预冷的溶液，交联时间为30min；
14、所述去除内层牺牲墨水采用的方法包括：将交联成型的结构浸泡于37℃预热的磷酸缓冲液中。
15、本专利技术还提供了由所述制备方法制得的仿生肝小叶脉管结构。
16、本专利技术打印的仿生肝小叶脉管结构为中空圆孔管道的肝小叶状六边形结构，该结构包含等分的肝窦区，本领域技术人员可根据实际情况确定分的份数。本专利技术中，所述等分可以为6～96等分，具体可为6、12、24、48或96等分。
17、本专利技术还提供一种仿生微肝组织的制备方法，包括：
18、将血管内皮细胞与干细胞球重悬于同一水凝胶中，获得混合物；
19、将所述混合物加入到仿生肝小叶样脉管结构的间隙中，孵育，待所述水凝胶成胶后加入肝分化培养基诱导间充质干细胞肝向分化，获得仿生微肝组织；
20、所述干细胞球包括间充质干细胞球、胚胎干细胞球、诱导多能干细胞球和肝母细胞球中的一种或多种。
21、本专利技术的一些具体实施例中，所述干细胞球为间充质干细胞球。具体地，所述间充质干细胞球通过微孔培养获得，也可通过其他方法制得，如：低吸附培养皿培养、在stemcell technologies inc.的aggrewelltm产品上培养、多孔培养皿培养、悬滴培养、微流体技术制得的微球培养、搅拌生物反应器动态培养等。
22、本专利技术通过控制细胞接种量和使用不同规格的微孔获得不同尺寸的间充质干细胞球。一些实施方案中，所述干细胞球的直径为50～150μm，具体可为50μm、100μm、150μm。本专利技术比较了摄氧极限距离内(200微米)的各细胞球尺寸(50μm、100μm、150μm和200μm)对其肝向分化的影响，并确定了50微米直径大小为最优尺寸，可使间充质干细胞球的肝向分化效率最高。
23、本专利技术中，所述血管内皮细胞和干细胞球的细胞数量比例为(0～4):1；一些具体实施例中，所述比例具体为2:1、3:1或4:1。在一个具体实施例中，本专利技术将血管内皮细胞与间充质干细胞球(直径50微米)以不同比例(0:1、1:1、2:1和4:1)在肝脱细胞基质水凝胶中共培养并诱导间充质干细胞肝向分化，比较了肝功能相关基因在(a)mrna和(b)蛋白水平上的表达差异，结果显示：血管内皮细胞和间充质干细胞球2:1的共培养比例显著促进间充质干细胞的肝向分化。
24、本专利技术中，所述仿生肝小叶样脉管结构为本专利技术前文制备方法制得的肝小叶样脉管结构，具有六边形中空连通的血管结构。
25、本专利技术中，所述血管内皮细胞包括：来源于脐静脉、肝窦、动脉、真皮层微血管的内皮细胞或由干细胞分化的血管内皮细胞。一些具体实施例中，所述血管内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。
26、本专利技术中，所述孵育的时间为37℃，时间为1小时，所述肝向分化的诱导时间为23天。
27、本专利技术中，所述水凝胶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种仿生肝小叶样脉管结构的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述外层支撑墨水包括血管内皮细胞和如下质量分数的组分：0.1-2％海藻酸钠、1-8％明胶和0.1-10％纤维蛋白原；所述内层牺牲墨水包括1-8％明胶、0.1-2％透明质酸钠和1-100单元/毫升凝血酶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述打印的条件为：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述交联溶液包括40mmol/L氯化钙、0.9wt％氯化钠和8单元/ml凝血酶；所述交联溶液为4℃预冷的溶液，交联时间为30min；
5.权利要求1～4任一项所述制备方法制得的仿生肝小叶脉管结构。
6.一种仿生微肝组织的制备方法，其特征在于，包括：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞球的直径为50～150μm；所述血管内皮细胞和干细胞球的细胞密度比例为(1～4):1。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述血管内皮
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述水凝胶为肝脱细胞基质水凝胶，或为由包括如下原料制成制成的水凝胶：明胶、透明质酸、聚乙二醇及其衍生物。
10.权利要求6～9任一项所述的制备方法制得的微肝组织在肝毒性药物或化妆品的安全性评测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种仿生肝小叶样脉管结构的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述外层支撑墨水包括血管内皮细胞和如下质量分数的组分：0.1-2％海藻酸钠、1-8％明胶和0.1-10％纤维蛋白原；所述内层牺牲墨水包括1-8％明胶、0.1-2％透明质酸钠和1-100单元/毫升凝血酶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述打印的条件为：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述交联溶液包括40mmol/l氯化钙、0.9wt％氯化钠和8单元/ml凝血酶；所述交联溶液为4℃预冷的溶液，交联时间为30min；
5.权利要求1～4任一项所述制备方法制...
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