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【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物大分子检测,具体涉及蛋白质分离和定量方法。
技术介绍
1、“无fc端的高表达低宿主细胞残留蛋白干扰的蛋白浓度检测”是一种滴度反相(titer_rp)浓度检测方法,即针对促进adc分子和蛋白结合的酶(intelli nuclease,wuxibiologics)的检测,这种酶无fc端,其活性成分是通过重组dna技术在大肠杆菌宿主细胞中产生的蛋白质。
2、考虑到商业化生产的实验分析过程中可能会遇到或应用到这种酶,期望此方法(反相液相检测浓度)可以被总结成一种检测方法或将可以应用到类似酶浓度的检测实验。
3、关于工业化生产中的滴度测定,对于产品的检测最大干扰就必须要提到杂质的影响。随着对产品质量更高要求以及更复杂的抗体类型,生产工艺参数及分析检测结果也随之更具挑战。而具有参考价值的检测杂质浓度结果的方法就必须在检测过程“瓶颈”寻求新的方法,进行优化,评估替代传统的分离分析技术。
4、上游产品滴度主要取决于生物学限度,与投入成本无关;下游产品滴度主要取决于加工时间、材料消耗、成本的投入,总体呈现正相关的增长趋势。若产品低度较低,则上游成本增加,导致整体成本与产品滴度的增长呈非线性趋势。尤其当为优化产品滴度时,因改良下游工艺参数而导致杂质种类及浓度变化的结果,更是放大了这种问题。检测检查过程遇到无fc端的抗体蛋白,则正常方法无法满足有效检测。因此找到合适的针对无fc端蛋白检测的方法亟需解决。
5、日常检测浓度使用的平台方法titer(滴度),即蛋白a色谱法是捕获抗体从而达到检测
6、滴度法可满足日常检测正常的或含有fc端的抗体蛋白。另外一个比较常见的问题是:hcp或dna类杂质与目标产品被一起产出,使这种待测样品也一块被蛋白a捕获,降低了protien a的结合能力,导致最终检测结果异常,高于产品实际浓度。tarrant et al.(2012)[86]和shukla et al.(2008)发表了关于hcp与不同蛋白a基质和产品相互作用的研究。
7、滴度法虽然可以利用蛋白a能与多数哺乳动物的igg或fc端特异性结合,但对于无fc端的抗体蛋白,却不能达到有效检测。
8、另外因需要对包含了较多杂质的发酵液进行直接检测,故需要有特异性抓取蛋白的方法,而蛋白生产过程中的宿主细胞残留蛋白会对检测结果产生影响也较大。
9、本领域仍然需要寻找一种能够实现对不含fc区的蛋白质进行快速精确分离、纯化和定量的方法。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题,本申请的一个方面提供了一种反相色谱方法,所述方法包括:
2、(i)用第一流动相对反相色谱介质进行平衡;
3、(ii)在所述平衡的反相色谱介质上加载样品;和
4、(iii)用第二流动相对所述加载的反相色谱介质进行洗脱,
5、其中,所述第一流动相和所述第二流动相包括流动相a和流动相b,所述流动相a包括三氟乙酸和水,并且所述流动相b包括三氟乙酸、乙腈、水和c2-6烷基醇。
6、本专利技术的另一个方面提供了一种蛋白质分离方法,所述方法包括:
7、(a)制备包含蛋白质的样品;和
8、(b)对所述样品进行反相色谱方法以分离蛋白质,所述反相色谱方法包括:
9、(i)用第一流动相对反相色谱介质进行平衡;
10、(ii)在所述平衡的反相色谱介质上加载样品;和
11、(iii)用第二流动相对所述加载的反相色谱介质进行洗脱,
12、其中,所述第一流动相和所述第二流动相包括流动相a和流动相b,所述流动相a包括三氟乙酸和水,并且所述流动相b包括三氟乙酸、乙腈、水和c2-6烷基醇。
13、本专利技术的另一个方面提供了一种蛋白质定量方法,所述方法包括:
14、(a)制备蛋白质标准品;
15、(b)对所述蛋白质标准品进行反相色谱方法以制备标准曲线,所述反相色谱方法包括:
16、(i)用第一流动相对反相色谱介质进行平衡;
17、(ii)在所述平衡的反相色谱介质上加载样品;和
18、(iii)用第二流动相对所述加载的反相色谱介质进行洗脱,
19、其中,所述第一流动相和所述第二流动相包括流动相a和流动相b,所述流动相a包括三氟乙酸和水,并且所述流动相b包括三氟乙酸、乙腈、水和c2-6烷基醇;
20、(c)对包含蛋白质的样品进行反相色谱方法,所述反相色谱方法包括:
21、(i)用第一流动相对反相色谱介质进行平衡;
22、(ii)在所述平衡的反相色谱介质上加载样品;和
23、(iii)用第二流动相对所述加载的反相色谱介质进行洗脱,
24、其中,所述第一流动相和所述第二流动相包括流动相a和流动相b,所述流动相a包括三氟乙酸和水,并且所述流动相b包括三氟乙酸、乙腈、水和c2-6烷基醇;和
25、(d)基于所述标准曲线和(c)的结果对所述样品中的蛋白质定量。
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1.一种反相色谱方法,所述方法包括:
2.如权利要求1所述的方法,其中所述反相色谱介质包括多孔层填料,优选包括固体硅胶芯和其上覆盖的多孔硅胶,更优选Poroshell 300SB-C8柱。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述样品包含蛋白质,所述蛋白质是不含Fc区的蛋白质,优选不含Fc区的酶或不含Fc区的抗体。
4.如权利要求1所述的方法,其中第一流动相包括70%-100%的流动相A和0-30%的流动相B,优选75%-85%的流动相A和15%-25%的流动相B,更优选80%的流动相A和20%的流动相B,并且任选地,步骤(i)持续5-30min,优选10-20min,更优选15min。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述第二流动相包括以下梯度:
6.如权利要求1所述的方法,其中所述流动相A包括:0.05%-0.2%的三氟乙酸,优选0.1%的三氟乙酸;并且所述流动相B包括:0.05%-0.2%的三氟乙酸,优选0.1%的三氟乙酸,5%-30%的乙腈,优选10%的乙腈,和60%-85%的C2-6烷基醇,优选80%的C2-6烷基
7.如权利要求1所述的方法,其中所述C2-6烷基醇包括乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇或其组合,优选正丙醇和/或异丙醇,更优选正丙醇。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述方法包括以下条件中的一项或多项:
9.一种蛋白质分离方法,所述方法包括:
10.一种蛋白质定量方法,所述方法包括:
...【技术特征摘要】
1.一种反相色谱方法,所述方法包括:
2.如权利要求1所述的方法,其中所述反相色谱介质包括多孔层填料,优选包括固体硅胶芯和其上覆盖的多孔硅胶,更优选poroshell 300sb-c8柱。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述样品包含蛋白质,所述蛋白质是不含fc区的蛋白质,优选不含fc区的酶或不含fc区的抗体。
4.如权利要求1所述的方法,其中第一流动相包括70%-100%的流动相a和0-30%的流动相b,优选75%-85%的流动相a和15%-25%的流动相b,更优选80%的流动相a和20%的流动相b,并且任选地,步骤(i)持续5-30min,优选10-20min,更优选15min。
5.如权利要求1所述的方法,其中所...
【专利技术属性】
技术研发人员:吴林,黄哲,张璐,盛慧莹,李志国,徐意人,
申请(专利权)人:上海药明生物技术有限公司,
类型:发明
国别省市:
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