一种利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法，该方法预先将原料奶离心处理，除去其中的脂肪层和水层，得到富含嗜冷菌菌体和乳蛋白质的沉淀物层；在无菌三羟甲基氨基甲烷－盐酸缓冲液中将沉淀物层中的嗜冷菌活菌体的氨肽酶与Ｌ－丙氨酸－对硝基苯胺直接进行氨肽酶反应，最大限度的保证了嗜冷菌的存活，然后再除掉体系中的乳蛋白，提取清澈的反应液，避免了预先提取嗜冷菌菌体而存在的活菌回收率高低的问题，减小了实验的系统误差，同时可利用待测液吸光值与嗜冷菌数量之间的对应关系，对原料奶中嗜冷菌的数量进行定量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品微生物检测领域，具体涉及一种利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷 菌的方法。
技术介绍
嗜冷菌，是一类最适生长温度等于或低于15°C，最高生长温度不高于20°C的微生 白勺>@禾尔(Morita, Psychrophilic bacteria，《Bacteriological Reviews》，1975，39 (2)， 144-167)。这类微生物广泛的存在于自然界中，与人类的生产生活密切相关。近年来，随着乳品行业的迅速发展，乳制品的产量大幅增加，使得乳制品安全问题 成为人们所关注的焦点之一。在我国的乳品企业中，原料奶从收集到生产加工可能需要在 4°C存放一至数天，这一过程使嗜冷菌在原料奶中大量繁殖，并产生极耐热的蛋白酶和脂肪 酶(即耐热酶)(杜晓明，潘涔轩，赵娟.乳中低温菌的来源、危害及其控制方法；《中国乳 业》，2002，11，28-30)。这些具有活性的耐热酶即使在经过高温处理后仍会有少量残留，残 留的耐热酶在成品奶制品储藏的过程中会继续分解脂肪和蛋白质，从而导致产品品质发生 变化，出现苦味、腐败味、脂肪氧化味或形成胶凝，严重制约了乳品工业的发展。研究发现，乳制品中残留的耐热酶的数量与原料奶中嗜冷菌数量息息相关。若要 保证乳制品的质量安全，就要在生产中了解原料奶中嗜冷菌的污染情况，并且采取措施严 格控制原料奶中嗜冷菌的数量。传统检测嗜冷菌的方法是将样品在7°C下培养10天后进行 计数，此方法虽然结果准确，但是检测方法耗时过长，在实际生产中从检测开始到检测结果 出来，被检测原料奶大多已被制成成品，或已进入市场，为奶制品的质量安全带来隐患。因 此，研发出一种及快速又实用的嗜冷菌检测方法十分必要，已成为乳品行业关注的焦点。国外早在上个世纪七八十年代就开始研究检测原料奶中嗜冷菌数量的方法，如直 接荧光过滤法(DEFT法)、电阻抗法、流动血细胞法、荧光定量法(RCR法)和酶联免疫吸附 测定法(ELISA法)，虽然这些方法都较好的运用了时下的新兴技术，得到的结果与传统的 嗜冷菌检测方法得到的结果有着非常好的相关性。但是从检测时间和检测成本上来说，都 不适合在工业中应用，达不到工厂对于嗜冷菌实时监测的要求。在国内，虽然我国原料奶受嗜冷菌污染问题很突出，但是学术界对于检测原料奶 中嗜冷菌的研究起步还是比较晚的。尽管如此，国内学者还是研究出了一些快速检测原料 奶中嗜冷菌的方法，如王克新等人在“液体乳中嗜冷菌数的测定”一文中对嗜冷菌培养条 件进行了改进，他认为将嗜冷菌培养条件设定为21°C下培养48小时，其在缩短检测时间的 前提下得到的检测结果与传统检测方法得到的检测结果不存在显著性差异(王克新，房国 玉，张丽宏；液体乳中嗜冷菌数的测定；《中国乳品工业》，2007，29 (5)，31-32)。纪振杰等人 在“原料乳中嗜冷菌数的检测方法的比较” 一文中利用了 3M细菌总数测试纸片，对原料奶 中嗜冷菌进行了检测，其检测结果与传统嗜冷菌检测方法结果之间不存在显著性差异，是 一种可取的检测方法；且利用显色剂培养出有色菌落，便于计数(纪振杰，郭德军，王欣；原 料乳中嗜冷菌数的检测方法的比较；《乳品科学与技术》，2007，29 (3)，131-132)。任静和张兰威在“原料乳中嗜冷菌的检测” 一文中则探究了嗜冷菌繁殖过程中产生的耐热脂肪酶与 嗜冷菌数量之间的关系，通过测定该脂肪酶的活力，从而间接检测出嗜冷菌的数量；虽然该 方法得到了嗜冷菌数和酶活之间极显著的线性关系，但是相关系数并不是很高，所以该方 法还需继续探究如何提高菌数和脂肪酶活性之间的线性相关系(任静，张兰威；原料乳中 嗜冷菌的检测；《食品工业科技》，2007，28 (3)，217-220)。以上这些方法都可以作为传统嗜 冷菌检测方法的替代方法，但是由于这些检测方法本身的不足，如检测成本和检测时间的 局限性，使得这些方法很少被应用于乳制品厂对嗜冷菌的实际检测中。氨肽酶法是一种基于革兰氏阴性嗜冷菌细胞壁上氨肽酶活性的特点而研发 出来的一种快速检测原料奶中嗜冷菌的方法(Cerny，Method for a distinction of Gram negative from Gram positive bacteria,《European Journal of Applied Microbiology)), 1976，3 (3)，223-225)，最早应用于检测冷藏猪肉和冷冻肉糜中嗜冷菌的数 量。由于革兰氏阴性嗜冷菌占冷藏原料奶中嗜冷菌数量的绝大部分，是原料奶中主要的微 生物类群；革兰氏阴性细菌细胞壁都具有氨肽酶，而且活性很高，能够裂解底物；在相同的 条件下革兰氏阳性细菌却不能裂解底物或只表现出很弱的裂解活性。因此，目前也利用氨 肽酶法来检测原料奶中的嗜冷菌的数量，主要是基于革兰氏阴性嗜冷菌细胞壁的氨肽酶活 性对原料奶中的嗜冷菌的数量进行检测的，多以无色的L-丙氨酸-对硝基苯胺作为氨肽 酶反应的底物，通过革兰氏阴性嗜冷菌细胞壁氨肽酶的作用使底物裂解成对硝基苯胺(黄 色)，用紫外分光光度计测定反应后溶液的吸光值，得出样品中氨肽酶的活性，然后在氨肽 酶活性和嗜冷菌数量之间建立了一种线性关系，依据这个线性关系，就可以通过测定样品 反应后溶液的吸光值，得出样品中氨肽酶的活性，从而推知样品中嗜冷菌的数量(Begofia， et al. , Method for a distinction of Gram negative from Gram positive bacteria, 《European Journal of Applied Microbiology》，1988, 3(3), 223-225 ;Susana, et al. , A rapid method for the estimation of the microbiological quality of refrigerated raw milk based on the aminopeptidase activity of Gram-negative bacteria, ((International Dairy Journal》，2005，15 (1)，79-84)。一般原料奶中嗜冷菌数量越多，革 兰氏阴性嗜冷菌数量就越多，氨肽酶分解底物活性高，底物被分解生成的对硝基苯胺的量 越多，反应后的样品溶液吸光值越高。Begofia和Susana等研究人员利用此方法对冷藏猪肉、冷冻肉糜、冷藏原料奶中 的嗜冷菌进行了检测，得到氨肽酶活性和嗜冷菌数之间良好的线性关系，建立了反应溶液 的吸光值和嗜冷菌数量之间的对应关系，并证明了氨肽酶法和传统的微生物计数方法之间 存在很高的相关性，表明氨肽酶法可以作为一种稳定的、准确的快速检测原料奶中嗜冷菌 的新方法；该利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法的工艺流程图见图1。氨肽酶法具有精确度高，操作简单，成本低且检测时间短等优点，能够满足乳制品 厂的要求。如传统的嗜冷菌检测方法(即嗜冷菌检测国际标准IDF Standard 101A)的检 测时间为10天，而氨肽酶法的检测时间一般为2. 5小时左右，达到了工厂需要快速检测原 料奶中嗜冷菌数量的要求。与其他现有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法，包括步骤：（１）取两份相同且等量的原料奶，将两份原料奶均在温度为３℃～５℃和转速为８０００转／分钟～１００００转／分钟的条件下离心１５分钟～２５分钟，得到两份分为脂肪层、水层和沉淀物层的离心物；（２）分别除去上述两份离心物中的脂肪层和水层并收集沉淀物层，将收集的沉淀物层溶于ｐＨ值为８．０且浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ的无菌三羟甲基氨基甲烷－盐酸缓冲液中，再加入Ｌ－丙氨酸－对硝基苯胺，相应的得到第一预处理液和第二预处理液；（３）将第一预处理液在３５℃～３７℃水浴振荡２小时～２．５小时，转速为１００转／分钟～１５０转／分钟，得到待测液；将第二预处理液在０℃～２℃静置２小时～２．５小时，作为空白对照液；（４）将上述待测液和空白对照液按以下步骤进行相同处理：在待测液和空白对照液中分别加入ｐＨ值为４．５～４．７的醋酸－醋酸钠缓冲溶液，均在３８℃～４２℃水浴９分钟～１１分钟，然后于转速为３０００转／分钟～３５００转／分钟的条件下离心１２分钟～１８分钟，分别取上清液，过滤得到待测液的滤液以及空白对照液的滤液，以空白对照液的滤液做对照，在紫外分光光度计上测定待测液的滤液的吸光值；（５）通过吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线，以及嗜冷菌数量与对硝基苯胺浓度之间的数量关系，得出原料奶中嗜冷菌的数量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶兴乾，吕元，刘东红，陈健初，吴丹，唐佳妮，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]