【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开内容涉及分子生物学和重组核酸。特别地，本公开内容涉及被工程化以识别和切割在人类线粒体基因组中发现的识别序列的重组大范围核酸酶。本公开内容还涉及这种重组大范围核酸酶在生产遗传修饰的真核细胞的方法中的用途，以及涉及遗传修饰的真核细胞群，其中线粒体dna已被修饰。通过efs-web作为文本文件提交的序列表的引用本申请包含序列表，其已经通过efs-web以ascii格式提交，并且将其整体通过引用并入本文。所述ascii副本，于2022年4月21日创建，名为p89339_0139_5_seqlist_4-21-22.txt，并且大小为80.6kb。
技术介绍
1、在所有生物体中，线粒体在正常生长和发育下以及应激反应中调节细胞能量和代谢。很多起这些作用的蛋白都是在线粒体基因组中编码的。因此，线粒体基因组的编辑在动物和植物中都有不同的应用。在人类中，有害的线粒体突变是很多疾病的来源，可以将基因编辑疗法应用于这些疾病。
2、致病性线粒体dna(mtdna)突变包括蛋白编码、转移rna(trna)或核糖体rna(rrna)基因的大规模重排和点突变。尽管mtdna相关疾病诊断的患病率约为1/5,000，但十种最常见的致病性mtdna突变的群体频率要高得多，接近1/200，这意味着很多“正常”个体携带低水平的突变基因组(schon等，nat rev gen 13:878-890(2012))。
3、在大多数情况下，突变的mtdna与患者细胞中的野生型mtdna共存(mtdna异质性)。几项研究表明，野生型mtdna具有很
4、然而，mtdna操作仍然是一个未被探索的科学领域，因为无法高效地靶向mtdna并产生精确的编辑。线粒体基因组很难编辑，因为其需要可预测的修复机制和向该细胞器递送编辑技术。鉴于线粒体基因组编辑相关的困难和不可预测性，存在对线粒体dna精确编辑的尚未得到满足的需求，这将在生命科学中开辟一个完整的等待探索和充满机会的领域。以更可预测的方式靶向和编辑线粒体基因组的限定区域(优选仅限于一个基因)的能力将明显优于目前可用的系统。
技术实现思路
1、本文提供了用于精确编辑线粒体基因组的组合物和方法。到目前为止，线粒体基因组编辑的尝试已经导致了大量不可预测的缺失/重排。本专利技术证明，工程化的大范围核酸酶可以导致线粒体dna(mtdna)的精确编辑，从而在生命科学中开辟了一个完整的等待探索和充满机会的领域。本文提供的组合物和方法可用于编辑一个特定的线粒体基因而不影响周围区域。
2、在一个方面中，本专利技术提供了一种线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(mtem)，其结合和切割在真核细胞的线粒体基因组中包含seq id no:1的识别序列，其中所述mtem包含附接至线粒体转运肽(mtp)的工程化大范围核酸酶，其中所述工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中第一亚基结合至识别序列的第一识别半位点并包含第一高变(hvr1)区，并且其中第二亚基结合至识别序列的第二识别半位点并包含第二高变(hvr2)区。
3、在一些实施方式中，所述hvr1区包含与对应于seq id no:3-12的任一个的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述hvr1区包含对应于seq id no:3-12的任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，所述hvr1区包含对应于seq id no:3-12的任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，所述hvr1区在对应于seq id no:3-12的任一个的残基66的残基处包含y、r、k或d。在一些实施方式中，所述hvr1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的seq id no:3-12的任一个的残基24-79。在一些实施方式中，所述hvr1区包含seq id no:3-12的任一个的残基24-79。
4、在一些实施方式中，所述第一亚基包含与seq id no:3-12的任一个的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一亚基包含对应于seq id no:3-12的任一个的残基19的残基。在一些实施方式中，所述第一亚基包含对应于seq id no:3、5、7、9、11或12的任一个的残基80的残基。在一些实施方式中，所述第一亚基在对应于seq id no:3-12的任一个的残基19的残基处包含g、s或a。在一些实施方式中，所述第一亚基在对应于seq id no:3-12的任一个的残基80的残基处包含e、q或k。在一些实施方式中，所述第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的seq id no:3-12的任一个的残基7-153。在一些实施方式中，所述第一亚基包含seq id no:3-12的任一个的残基7-153。
5、在一些实施方式中，所述hvr2区包含与对应于seq id no:3-12的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述hvr2区包含对应于seq id no:3-12的任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，所述hvr2区包含对应于seq id no:3-12的任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，所述hvr2区包含对应于seq id no:3-12的任一个的残基241的残基。在一些实施方式中，所述hvr2区包含对应于seq id no:3或5-12的任一个的残基263的残基。在一些实施方式中，所述hvr2区包含对应于seq i本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)，其结合和切割在真核细胞的线粒体基因组中包含SEQ ID NO:1的识别序列，其中所述MTEM包含附接至线粒体转运肽(MTP)的工程化大范围核酸酶，其中所述工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基结合至所述识别序列的第一识别半位点，并包含第一高变(HVR1)区，并且其中所述第二亚基结合至所述识别序列的第二识别半位点，并包含第二高变(HVR2)区。
2.根据权利要求1所述的MTEM，其中所述HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的MTEM，其中所述HVR1区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的MTEM，其中所述HVR1区包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79。
5.根据权利
6.根据权利要求1-5中任一项所述的MTEM，其中所述第一亚基包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基19的残基。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的MTEM，其中所述第一亚基包含对应于SEQ ID NO:3、5、7、9、11或12的任一个的残基80的残基。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的MTEM，其中所述第一亚基包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基7-153。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基241的残基。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3或5-12的任一个的残基263的残基。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-6或8-12的任一个的残基264的残基。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:6的残基265的残基。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-270。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的MTEM，其中所述第二亚基包含与SEQ ID NO:3-12的任一个的残基198-344具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的MTEM，其中所述第二亚基包含对应于SEQ IDNO:4的残基276的残基。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的MTEM，其中所述第二亚基包含对应于SEQ IDNO:3-12的任一个的残基330的残基。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的MTEM，其中所述第二亚基包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基198-344。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的MTEM，其中所述工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中所述接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的MTEM，其中所述工程化大范围核酸酶包含与SEQID NO:3-12的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的MTEM，其中所述工程化大范围核酸酶包含SEQID NO:3-12的任一个的氨基酸序列。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的MTEM，其中所述工程化大范围核酸酶由与SEQID NO:33-42的任一个的核酸序列具有至少8...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(mtem)，其结合和切割在真核细胞的线粒体基因组中包含seq id no:1的识别序列，其中所述mtem包含附接至线粒体转运肽(mtp)的工程化大范围核酸酶，其中所述工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基结合至所述识别序列的第一识别半位点，并包含第一高变(hvr1)区，并且其中所述第二亚基结合至所述识别序列的第二识别半位点，并包含第二高变(hvr2)区。
2.根据权利要求1所述的mtem，其中所述hvr1区包含与对应于seq id no:3-12的任一个的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的mtem，其中所述hvr1区包含对应于seq id no:3-12的任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的mtem，其中所述hvr1区包含seq id no:3-12的任一个的残基24-79。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的mtem，其中所述第一亚基包含与seq id no:3-12的任一个的残基7-153具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的mtem，其中所述第一亚基包含对应于seq id no:3-12的任一个的残基19的残基。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的mtem，其中所述第一亚基包含对应于seq id no:3、5、7、9、11或12的任一个的残基80的残基。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的mtem，其中所述第一亚基包含seq id no:3-12的任一个的残基7-153。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的mtem，其中所述hvr2区包含与对应于seq id no:3-12的任一个的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的mtem，其中所述hvr2区包含对应于seq id no:3-12的任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的mtem，其中所述hvr2区包含对应于seq id no:3-12的任一个的残基241的残基。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的mtem，其中所述hvr2区包含对应于seq id no:3或5-12的任一个的残基263的残基。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的mtem，其中所述hvr2区包含对应于seq id no:3-6或8-12的任一个的残基264的残基。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的mtem，其中所述hvr2区包含对应于seq id no:6的残基265的残基。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的mtem，其中所述hvr2区包含seq id no:3-12的任一个的残基215-270。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的mtem，其中所述第二亚基包含与seq id no:3-12的任一个的残基198-344具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的mtem，其中所述第二亚基包含对应于seq idno:4的残基276的残基。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的mtem，其中所述第二亚基包含对应于seq idno:3-12的任一个的残基330的残基。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的mtem，其中所述第二亚基包含seq id no:3-12的任一个的残基198-344。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的mtem，其中所述工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中所述接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的mtem，其中所述工程化大范围核酸酶包含与seqid no:3-12的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的mtem，其中所述工程化大范围核酸酶包含seqid no:3-12的任一个的氨基酸序列。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的mtem，其中所述工程化大范围核酸酶由与seqid no:33-42的任一个的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列编码。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的mtem，其中所述工程化大范围核酸酶由seq idno:33-42的任一个的核酸序列编码。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的mtem，其中所述mtp包含与seq id no:43-45的任一个中所示的序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的mtem，其中所述mtp包含seq id no:43-45的任一个中所示的氨基酸序列。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的mtem，其中所述mtp附接至所述工程化大范围核酸酶的c末端。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的mtem，其中所述mtp附接至所述工程化大范围核酸酶的n末端。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的mtem，其中所述mtp与所述工程化大范围核酸酶融合。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的mtem，其中所述mtp通过多肽接头附接至所述工程化大范围核酸酶。
31.根据权利要求1-24中任一项所述的mtem，其中所述工程化大范围核酸酶附接至第一mtp和第二mtp。
32.根据权利要求31所述的mtem，其中所述第一mtp和/或所述第二mtp包含与seq idno:43-45的任一个中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的mtem，其中所述第一mtp和/或所述第二mtp包含seq id no:43-45的任一个中所示的氨基酸序列。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的mtem，其中所述第一mtp和所述第二mtp是相同的。
35.根据权利要求31-33中任一项所述的mtem，其中所述第一mtp和所述第二mtp是不同的。
36.根据权利要求31-35中任一项所述的mtem，其中所述第一mtp和/或所述第二mtp与所述工程化大范围核酸酶融合。
37.根据权利要求31-35中任一项所述的mtem，其中所述第一mtp和/或所述第二mtp通过多肽接头附接至所述工程化大范围核酸酶。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的mtem，其中所述mtem附接至核输出序列(nes)。
39.根据权利要求38所述的mtem，其中所述nes包含与seq id no:46或47中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的mtem，其中所述nes包含seq id no:46或47中所示的氨基酸序列。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的mtem，其中所述nes附接在所述mtem的n末端处。
42.根据权利要求38-40中任一项所述的mtem，其中所述nes附接在所述mtem的c末端处。
43.根据权利要求38-42中任一项所述的mtem，其中所述nes与所述mtem融合。
44.根据权利要求38-42中任一项所述的mtem，其中所述nes通过多肽接头附接至所述mtem。
45.根据权利要求1-37中任一项所述的mtem，其中所述mtem附接至第一nes和第二nes。
46.根据权利要求45所述的mtem，其中所述第一nes附接在所述mtem的n末端处，和其中所述第二nes附接在所述metm的c末端处。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的mtem，其中所述第一nes和/或所述第二nes包含与seq id no:46或47中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的mtem，其中所述第一nes和/或所述第二nes包含seq id no:46或47中所示的氨基酸序列。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的mtem，其中所述第一nes和所述第二nes是相同的。
50.根据权利要求45-48中任一项所述的mtem，其中所述第一nes和所述第二nes是不同的。
51.根据权利要求45-50中任一项所述的mtem，其中所述第一nes和/或所述第二nes与所述mtem融合。
52.根据权利要求45-50中任一项所述的mtem，其中所述第一nes和/或所述第二nes通过多肽接头附接至所述mtem。
53.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1-52中任一项的所述mtem的核酸序列。
54.根据权利要求53所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是mrna。
55.一种重组dna构建体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1-52中任一项的所述mtem的核酸序列。
56.根据权利要求55所述的重组dna构建体，其中所述重组dna构建体编码包含所述多核苷酸的重组病毒。
57.根据权利要求56所述的重组dna构建体，其中所述重组病毒是重组腺病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺相关病毒(aav)。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的重组dna构建体，其中所述重组病毒是重组aav。
59.根据权利要求58所述的重组dna构建体，其中所述重组aav具有aav9衣壳。
60.根据权利要求55-59中任一项所述的重组dna构建体，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述mtem的所述核酸序列的启动子。
61.根据权利要求60所述的重组dna构建体，其中所述启动子是泛在启动子，或者其中所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。
62.根据权利要求61所述的重组dna构建体，其中所述泛在启动子是cmv启动子、cag启动子、ef1α启动子或ubc启动子。
63.一种重组病毒，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1-52中任一项的所述mtem的核酸序列。
64.根据权利要求63所述的重组病毒，其中所述重组病毒是重组腺病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺相关病毒(aav)。
65.根据权利要求63或权利要求64所述的重组病毒，其中所述重组病毒是重组aav。
66.根据权利要求65所述的重组病毒，其中所述重组aav具有aav9衣壳。
67.根据权利要求63-66中任一项所述的重组病毒，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述mtem的所述核酸序列的启动子。
68.根据权利要求67所述的重组病毒，其中所述启动子是泛在启动子，或者其中所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。
69.根据权利要求68所述的重组病毒，其中所述泛在启动子是cmv启动子、cag启动子、ef1α启动子或ubc启动子。
70.一种脂质纳米颗粒组合物，其包含脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码权利要求1-52中任一项的所述mtem的核酸序列。
71.根据权利要求70所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述多核苷酸是mrna。
72.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求1-52中任一项的所述mtem。
73.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求53或权利要求54的所述多核苷酸。
74.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求55-62中任一项的所述重组dna构建体。
75.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求63-69中任一项的所述重组病毒。
76.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求70或权利要求71的所述脂质纳米颗粒组合物。
77.一种遗传修饰的真核细胞，其包含权利要求1-52中任一项的所述多核苷酸。
78.根据权利要求77所述的遗传修饰的真核细胞，其中所述遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的哺乳动物细胞。
79.根据权利要求77或权利要求78所述的遗传修饰的真核细胞，其中所述遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的人细胞。
80.一种用于产生遗传修饰的真核细胞的方法，所述方法包括向真核细胞中引入：
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述切割位点通过非同源末端连接修复，以使得所述识别序列包含插入或缺失。
82.根据权利要求80所述的方法，其中包含所述识别序列的所述突变线粒体基因组在所述遗传修饰的真核细胞中被降解。
83.根据权利要求82所述的方法，其中约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的包含所述识别序列的突变线粒体基因组在所述遗传修饰的真核细胞中被降解。
84.根据权利要求82或权利要求83中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中野生型线粒体基因组与包含所述识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。
85.根据权利要求82-84中任一项所述的方法，其中所述比率增加至约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约20:1、约50:1、约100:1、约150:1、约200:1、约250:1、约300:1、约350:1、约400:1、约450:1、约500:1、约550:1、约600:1、约650:1、约700:1、约750:1、约800:1、约850:1、约900:1、约950:1、约1000:1或更高。
86.根据权利要求82-85中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中野生型线粒体基因组的百分比是在所述遗传修饰的真核细胞中总线粒体基因组的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
87.根据权利要求82-86中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中包含所述识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
88.根据权利要求82-87中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。
89.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中细胞呼吸增加约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更高。
90.一种用于产生包含多个遗传修饰的细胞的真核细胞群的方法，所述方法包括向在所述群中的多个真核细胞中引入：
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述切割位点通过非同源末端连接修复，以使得所述识别序列包含插入或缺失。
92.根据权利要求90所述的方法，其中包含所述识别序列的所述突变线粒体基因组在所述多个遗传修饰的真核细胞中被降解。
93.根据权利要求92所述的方法，其中约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的包含所述识别序列的突变线粒体基因组在所述多个遗传修饰的真核细胞中被降解。
94.根据权利要求92或权利要求93所述的方法，其中在所述多个遗传修饰的真核细胞中野生型线粒体基因组与包含所述识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。
95.根据权利要求92-94中任一项所述的方法，其中在所述真核细胞群中野生型线粒体基因组与包含所述识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。
96.根据权利要求92-95中任一项所述的方法，其中所述比率增加至约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约20:1、约50:1、约100:1、约150:1、约200:1、约250:1、约300:1、约350:1、约400:1、约450:1、约500:1、约550:1、约600:1、约650:1、约700:1、约750:1、约800:1、约850:1、约900:1、约950:1、约1000:1或更高。
97.根据权利要求92-96中任一项所述的方法，其中在所述多个遗传修饰的真核细胞中野生型线粒体基因组的百分比增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
98.根据权利要求92-97中任一项所述的方法，其中在所述真核细胞群中野生型线粒体基因组的百分比增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
99.根据权利要求92-98中任一项所述的方法，其中在所述多个遗传修饰的真核细胞中包含所述识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
100.根据权利要求92-99中任一项所述的方法，其中在所述真核细胞群中包含所述识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
101.根据权利要求92-100中任一项所述的方法，其中在所述多个遗传修饰的真核细胞中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·J·史密斯，G·汤姆贝林，J·莫里斯，W·舒普，C·T·莫赖斯，
申请(专利权)人：精密生物科学公司，
类型：发明
国别省市：
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