包含microRNA适应的shRNA(shRNAmiR)的遗传修饰的免疫细胞制造技术

本发明专利技术涵盖遗传修饰的免疫细胞(及其群体)，其表达降低靶内源性蛋白表达的microRNA适应的shRNA(shRNAmiR)。还提供了降低免疫细胞中的内源性蛋白表达的方法，其中所述方法包括引入靶向所述内源性蛋白的shRNAmiR。使用shRNAmiR来敲低靶蛋白的表达能够稳定敲低免疫细胞中内源性蛋白的表达。疫细胞中内源性蛋白的表达。疫细胞中内源性蛋白的表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含microRNA适应的shRNA(shRNAmiR)的遗传修饰的免疫细胞


[0001]本专利技术涉及肿瘤学、癌症免疫治疗、分子生物学和重组核酸
特别地，本专利技术涉及遗传修饰的免疫细胞，其包含能够稳定敲低特定靶基因的microRNA适应的shRNA(shRNAmiR)分子。本专利技术还涉及此类遗传修饰的免疫细胞用于在受试者中降低内源性蛋白的表达和治疗疾病(包括癌症)的用途。
[0002]引用通过EFS
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037WO_Seq_List_4
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20，并且大小为58,911字节。

技术介绍

[0004]T细胞过继免疫治疗是用于癌症治疗的有前景的方法。本文公开的免疫疗法治疗方法利用经遗传修饰的分离的人T细胞以增强其对特定肿瘤相关抗原的特异性。遗传修饰可能涉及嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的表达，以将抗原特异性移植到T细胞上。与外源性T细胞受体相比，嵌合抗原受体的特异性来源于单克隆抗体的可变结构域。因此，表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)以主要组织相容性复合体非限制的方式诱导肿瘤免疫反应性。T细胞过继免疫疗法已被用作许多癌症的临床疗法，包括B细胞恶性肿瘤(例如，急性淋巴母细胞白血病、B细胞非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、晚期神经胶质瘤、卵巢癌、间皮瘤、黑色素瘤、前列腺癌和胰腺癌等。
[0005]尽管其具有作为癌症治疗的潜在有用性，但是用CAR T细胞的过继免疫疗法部分受到细胞表面上内源性T细胞受体的表达的限制。表达内源性T细胞受体的CAR T细胞在施用于同种异体患者后可识别主要和次要组织相容性抗原，这可以导致移植物抗宿主病(GVHD)的发展。因此，临床试验已主要集中在使用自体CAR T细胞，其中分离患者的T细胞，进行遗传修饰以并入嵌合抗原受体，然后重新输注至同一患者体内。自体方法提供对施用的CAR T细胞的免疫耐受性；然而，这种方法受到在患者已诊断为癌症之后产生患者特异性CAR T细胞所需的时间和费用两者的限制。
[0006]因此，开发使用来自第三方健康供体的T细胞制备的具有降低的内源性T细胞受体(例如，α/βT细胞受体)表达或不具有可检测的细胞表面表达且在施用后不引发GVHD的“现成的(off the shelf)”CAR T细胞将是有利的。这样的产品可以在诊断之前产生和验证，并且可以在一旦必要时可用于患者。因此，需要开发缺乏内源性T细胞受体以防止GVHD的发生的同种异体CAR T细胞。
[0007]为此，为了完全敲除β
‑
2微球蛋白(B2M)蛋白表达，产生了对β
‑
2微球蛋白基因具有特异性的工程化大范围核酸酶(参见，例如，国际公开号WO 2017/112859)。B2M是主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的一个组成部分，如果没有B2M，其将不会在细胞表面组装。因
此，敲除B2M是一种消除MHC I类分子的方法，当将CAR T细胞施用于同种异体患者时，这会减少GVHD。
[0008]然而，完全消除CAR T细胞表面上的B2M和MHC I类分子表达的结果是，所述CAR T细胞变得更容易受到自然杀伤(NK)细胞的攻击，自然杀伤细胞将其视为非自身的。鉴于这种现象，开发了一种针对CAR T细胞的敲低方法，以产生不完全的B2M敲低(参见，例如，国际公开号WO 2018/208837)。本质上，包含B2M靶向shRNA编码序列的盒通过核酸酶介导的靶向插入引入T细胞的T细胞受体α恒定区基因。shRNA编码序列包含在盒中，该盒也包含CAR编码序列，允许产生TCR阴性、CAR阳性的CAR T细胞，并且具有细胞表面B2M的部分敲低。该项目中的数据表明，与完全敲除B2M的CAR T细胞相比，这些CAR T细胞确实更不容易被NK细胞杀死。
[0009]然而，如本文所述，进一步的实验表明，包含shRNA编码序列的盒不稳定，并且B2M敲低是暂时性的。最终，细胞从基因组中去除shRNA编码序列，导致B2M表达回归。因此，仍然需要产生能够稳定敲低内源性蛋白(如B2M)的CAR T细胞。在本领域中寻找该问题的答案时，本文发现了一种技术，该技术可用于在免疫细胞中产生不同程度的目标蛋白的基因敲低。

技术实现思路

[0010]本专利技术提供了遗传修饰的免疫细胞(及其群体)，其表达降低靶蛋白表达的microRNA适应的shRNA(shRNAmiR)。使用shRNAmiR敲低靶蛋白的表达可以稳定敲低蛋白表达，这对于那些首选敲低而不是敲除的靶蛋白来说是理想的。例如，通过表达B2M靶向shRNAmiR来以降低水平表达β
‑
2微球蛋白(B2M)的免疫细胞对自然杀伤(NK)细胞的细胞溶解作用比那些B2M表达已被基因失活敲除的细胞更不敏感。因此，进一步提供了通过引入包含编码shRNAmiR的核酸序列的模板核酸来降低免疫细胞中内源性蛋白表达的方法，所述核酸序列被插入到所述细胞的基因组中并被表达以降低所述内源性蛋白的表达。
[0011]因此，在一个方面中，本专利技术提供了一种遗传修饰的免疫细胞，其在基因组中包含编码microRNA适应的shRNA(shRNAmiR)的核酸序列。所述shRNAmiR在所述遗传修饰的免疫细胞中表达，并且在所述遗传修饰的免疫细胞中降低靶蛋白的表达。靶蛋白表达的降低由shRNAmiR引导序列与编码所述靶蛋白的mRNA的结合来介导。
[0012]在一些实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的T细胞，或由其衍生的细胞。在一些实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞，或由其衍生的细胞。在其他实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的B细胞，或由其衍生的细胞。在各种实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的单核细胞或巨噬细胞，或由其衍生的细胞。
[0013]在一些实施方式中，所述shRNAmiR从5
’
至3
’
包含：(a)5
’
miR支架结构域；(b)5
’
miR基干结构域；(c)随从链；(d)miR环结构域；(e)引导链；(f)3
’
miR基干结构域；和(g)3
’
miR支架结构域。
[0014]在一些实施方式中，所述miR环结构域是miR
‑
30a环结构域、miR
‑
15环结构域、miR
‑
16环结构域、miR
‑
155环结构域、miR
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22环结构域、miR
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103环结构域或miR
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107环结构域。在特定实施方式中，所述miR环本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种遗传修饰的免疫细胞，其在基因组中包含编码microRNA适应的shRNA(shRNAmiR)的核酸序列，其中所述shRNAmiR在所述遗传修饰的免疫细胞中表达，并且其中所述shRNAmiR降低所述遗传修饰的免疫细胞中靶蛋白的表达。2.根据权利要求1所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的T细胞，或由其衍生的细胞。3.根据权利要求1所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞，或由其衍生的细胞。4.根据权利要求1所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的B细胞，或由其衍生的细胞。5.根据权利要求1所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的单核细胞或巨噬细胞，或由其衍生的细胞。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述shRNAmiR从5
’
至3
’
包含：(a)5
’
miR支架结构域；(b)5
’
miR基干结构域；(c)随从链；(d)miR环结构域；(e)引导链；(f)3
’
miR基干结构域；和(g)3
’
miR支架结构域。7.根据权利要求6所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述miR环结构域是miR
‑
30a环结构域。8.根据权利要求7所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述miR
‑
30a环结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的核酸序列。9.根据权利要求8所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述miR
‑
30a环结构域包含SEQ ID NO:3的核酸序列。10.根据权利要求6
‑
9中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述shRNAmiR包含microRNA
‑
E(miR
‑
E)支架、miR
‑
30(例如miR
‑
30a)支架、miR
‑
15支架、miR
‑
16支架、miR
‑
155支架、miR
‑
22支架、miR
‑
103支架或miR
‑
107支架。11.根据权利要求10所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述shRNAmiR包含miR
‑
E支架。12.根据权利要求6
‑
11中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中：(a)所述5
’
miR支架结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的核酸序列；(b)所述5
’
miR基干结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的核酸序列；(c)所述3
’
miR基干结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性的核酸序列；和(d)所述3
’
miR支架结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的核酸序列。13.根据权利要求12所述的遗传修饰的免疫细胞，其中：(a)所述5
’
miR支架结构域包含SEQ ID NO:1的核酸序列；(b)所述5
’
miR基干结构域包含SEQ ID NO:2的核酸序列；
(c)所述3
’
miR基干结构域包含SEQ ID NO:4的核酸序列；和(d)所述3
’
miR支架结构域包含SEQ ID NO:5的核酸序列。14.根据权利要求1
‑
13中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含编码嵌合抗原受体(CAR)或外源性T细胞受体(TCR)的核酸序列，其中所述CAR或所述外源性TCR由所述遗传修饰的免疫细胞表达。15.根据权利要求1
‑
14中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含编码HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA
‑
E)融合蛋白的核酸序列。16.根据权利要求15所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述HLA
‑
E融合蛋白包含与SEQ ID NO:66具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。17.根据权利要求15或权利要求16所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述HLA
‑
E融合蛋白包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。18.根据权利要求14
‑
17中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于与编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列不同的基因内。19.根据权利要求18所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列、或者编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列位于TCRα基因或TCRα恒定区基因内。20.根据权利要求14
‑
17中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于与编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列相同的基因内。21.根据权利要求20所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述基因是TCRα基因或TCRα恒定区基因。22.根据权利要求20或权利要求21所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列和编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列在所述基因中的盒内。23.根据权利要求20
‑
22中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列和编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列与相同启动子可操作地连接。24.根据权利要求20
‑
23中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列；和(b)编码所述shRNAmiR的所述核酸序列。25.根据权利要求20
‑
23中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)编码所述shRNAmiR的所述核酸序列；和(b)编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列。26.根据权利要求20
‑
25中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列和编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列被2A或IRES序列所分隔。27.根据权利要求20
‑
26中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列具有相同定向。28.根据权利要求20
‑
26中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR
的所述核酸序列与编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列具有相反定向。29.根据权利要求20
‑
23中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中内含子序列位于编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列内，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内。30.根据权利要求22
‑
29中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述盒包含与编码所述shRNAmiR的所述核酸序列和编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列可操作地连接的启动子。31.根据权利要求22
‑
30中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述盒包含终止信号。32.根据权利要求15
‑
17中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于与编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列相同的基因内。33.根据权利要求32所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述基因是TCRα基因或TCRα恒定区基因。34.根据权利要求32或权利要求33所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列和编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列在所述基因中的盒内。35.根据权利要求32
‑
34中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列和编码所述HLA
‑
E融合蛋白的核酸序列与相同启动子可操作地连接。36.根据权利要求32
‑
35中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列；和(b)编码所述shRNAmiR的所述核酸序列。37.根据权利要求32
‑
35中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)编码所述shRNAmiR的所述核酸序列；和(b)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列。38.根据权利要求32
‑
37中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列被2A或IRES所分隔。39.根据权利要求32
‑
35中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中内含子序列位于编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列内，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内。40.根据权利要求34
‑
39中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述盒包含启动子，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列和编码所述HLA
‑
E融合蛋白的核酸序列与所述启动子可操作地连接。41.根据权利要求34
‑
40中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述盒包含终止信号。42.根据权利要求15
‑
17中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列、编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列和编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列位于相同基因内。
43.根据权利要求42所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述基因是TCRα基因或TCRα恒定区基因。44.根据权利要求42或权利要求43所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列、编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列和编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列在所述基因中的盒内。45.根据权利要求42
‑
44中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列、编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列和编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列与相同启动子可操作地连接。46.根据权利要求42
‑
45中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒包含：(a)编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列；(b)2A或IRES序列；(c)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列；和(d)编码所述shRNAmiR的所述核酸序列。47.根据权利要求42
‑
46所述的遗传修饰的免疫细胞，其中内含子序列位于编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列内，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内。48.根据权利要求42
‑
46中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中内含子序列位于编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列内，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内。49.根据权利要求44
‑
48中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述盒包含与编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列、编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列可操作地连接的启动子。50.根据权利要求44
‑
49中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述盒包含终止信号。51.根据权利要求45所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)启动子；(b)编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列；(c)2A或IRES序列；(d)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列，其中内含子序列位于编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列内，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(e)任选地，终止信号；其中编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列、编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。52.根据权利要求45所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)启动子；
NO:68具有至少80％序列同一性的核酸序列。60.根据权利要求58所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述polyA序列包含SEQ ID NO:68的核酸序列。61.根据权利要求58所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述BGH终止信号包含与SEQ ID NO:71具有至少80％序列同一性的核酸序列。62.根据权利要求58所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述BGH终止信号包含SEQ ID NO:71的核酸序列。63.根据权利要求23
‑
31、35
‑
41或45
‑
62中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:67具有至少80％序列同一性的核酸序列。64.根据权利要求23
‑
31、35
‑
41或45
‑
62中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述启动子包含SEQ ID NO:67的核酸序列。65.根据权利要求26
‑
28、30、31、38、40、41或46
‑
64中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述2A序列是包含与SEQ ID NO:70具有至少80％序列同一性的核酸序列的P2A/弗林蛋白酶位点。66.根据权利要求26
‑
28、30、31、38、40、41或46
‑
64中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述2A序列是包含SEQ ID NO:70的核酸序列的P2A/弗林蛋白酶位点。67.根据权利要求14
‑
66中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述CAR包含信号肽，所述信号肽包含与SEQ ID NO:73具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。68.根据权利要求14
‑
66中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述CAR包含信号肽，所述信号肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。69.根据权利要求45所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)包含与SEQ ID NO:67具有至少80％序列同一性的核酸序列的启动子；(b)编码所述CAR的所述核酸序列，其中所述CAR包含信号肽，所述信号肽包含与SEQ ID NO:73具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(c)包含与SEQ ID NO:70具有至少80％序列同一性的核酸序列的P2A/弗林蛋白酶位点；(d)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列，其中所述HLA
‑
E融合蛋白包含与SEQ ID NO:66具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列内，其中所述内含子序列包含与SEQ ID NO:69具有至少80％序列同一性的核酸序列，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(e)任选地，包含与SEQ ID NO:68具有至少80％序列同一性的核酸序列的终止信号；其中编码所述CAR的所述核酸序列、编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。70.根据权利要求45所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)包含SEQ ID NO:67的核酸序列的启动子；(b)编码所述CAR的所述核酸序列，其中所述CAR包含信号肽，所述信号肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；
(c)包含SEQ ID NO:70的核酸序列的P2A/弗林蛋白酶位点；(d)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列，其中所述HLA
‑
E融合蛋白包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列内，其中所述内含子序列包含SEQ ID NO:69的核酸序列，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(e)任选地，包含SEQ ID NO:68的核酸序列的终止信号；其中编码所述CAR的所述核酸序列、编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。71.根据权利要求69或权利要求70所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒包含与SEQ ID NO:74具有至少80％序列同一性的核酸序列，其中所述盒在基因组中位于TCRα恒定区基因内。72.根据权利要求69或权利要求70所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒包含SEQ ID NO:74的核酸序列，其中所述盒在基因组中位于TCRα恒定区基因内。73.根据权利要求20
‑
22中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列和编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列与不同启动子可操作地连接。74.根据权利要求73所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)第一启动子；(b)编码所述CAR或外源性TCR的所述核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码所述shRNAmiR的所述核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。75.根据权利要求73所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)第一启动子；(b)编码所述shRNAmiR的所述核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码所述CAR或外源性TCR的所述核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。76.根据权利要求73
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75中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与编码所述CAR或外源性TCR的所述核酸序列具有相同定向。77.根据权利要求83
‑
85中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与编码所述CAR或外源性TCR的所述核酸序列具有相反定向。78.根据权利要求74
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77中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。79.根据权利要求74
‑
77中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。80.根据权利要求74
‑
79中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述盒包含一个或多个终止信号。
81.根据权利要求20
‑
22中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列和编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列与不同启动子可操作地连接。82.根据权利要求81所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)第一启动子；(b)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码所述shRNAmiR的所述核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。83.根据权利要求81所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)第一启动子；(b)编码所述shRNAmiR的所述核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。84.根据权利要求80
‑
82中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。85.根据权利要求80
‑
82中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。86.根据权利要求82
‑
85中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述盒包含一个或多个终止信号。87.根据权利要求42
‑
44中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组内包含盒，所述盒包含：(a)编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列；(b)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列；和(c)编码所述shRNAmiR的所述核酸序列；其中编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列与第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与第二启动子可操作地连接。88.根据权利要求42
‑
44中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组内包含盒，所述盒包含：(a)编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列；(b)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列；和(c)编码所述shRNAmiR的所述核酸序列；其中编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列与第二启动子可操作地连接。89.根据权利要求87所述的遗传修饰的免疫细胞，其中内含子序列位于编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列内，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内。
90.根据权利要求88所述的遗传修饰的免疫细胞，其中内含子序列位于编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列内，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内。91.根据权利要求87
‑
90中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述盒包含能够终止所述CAR或所述外源性TCR的转录的第一终止信号，和能够终止所述HLA
‑
E融合蛋白的转录的第二终止信号。92.根据权利要求87
‑
90中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述盒包含能够终止所述HLA
‑
E融合蛋白的转录的第一终止信号，和能够终止所述CAR或所述外源性TCR的转录的第二终止信号。93.根据权利要求42
‑
44中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)第一启动子；(b)编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列，其中内含子序列位于编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列内，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。94.根据权利要求42
‑
44中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)第一启动子；(b)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列，其中内含子序列位于编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列内，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。95.根据权利要求42
‑
442中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)第一启动子；(b)编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列，其中内含子序列位于编码所述CAR
或所述外源性TCR的所述核酸序列内，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。96.根据权利要求42
‑
44中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)第一启动子；(b)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列，其中内含子序列位于编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列内，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述CAR或所述外源性TCR的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。97.根据权利要求89
‑
96中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述内含子序列是合成内含子序列。98.根据权利要求89
‑
96中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述内含子序列包含与SEQ ID NO:69具有至少80％序列同一性的核酸序列。99.根据权利要求89
‑
96中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述内含子序列包含SEQ ID NO:69的核酸序列。100.根据权利要求80或权利要求86所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述一个或多个终止信号是polyA序列或BGH终止信号。101.根据权利要求91
‑
99中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一终止信号和所述第二终止信号是相同的。102.根据权利要求101所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一终止信号和所述第二终止信号是polyA序列或BGH终止信号。103.根据权利要求91
‑
99中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一终止信号和所述第二终止信号是不同的。104.根据权利要求103所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一终止信号是polyA序列和所述第二终止信号是BGH终止信号。105.根据权利要求103所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一终止信号是BGH终止
信号和所述第二终止信号是polyA序列。106.根据权利要求100、102、104或105中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述polyA序列包含与SEQ ID NO:68具有至少80％序列同一性的核酸序列。107.根据权利要求100、102、104或105中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述polyA序列包含SEQ ID NO:68的核酸序列。108.根据权利要求100、102或104
‑
107中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述BGH终止信号包含与SEQ ID NO:71具有至少80％序列同一性的核酸序列。109.根据权利要求100、102或104
‑
107中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述BGH终止信号包含SEQ ID NO:71的核酸序列。110.根据权利要求74
‑
80或82
‑
109中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。111.根据权利要求110所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一启动子和所述第二启动子是JeT启动子或EF1α核心启动子。112.根据权利要求74
‑
80或82
‑
109中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。113.根据权利要求112所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一启动子是JeT启动子，并且其中所述第二启动子是EF1α核心启动子。114.根据权利要求112所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述第一启动子是EF1α核心启动子，并且其中所述第二启动子是JeT启动子。115.根据权利要求111、113或114中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述JeT启动子包含与SEQ ID NO:67具有至少80％序列同一性的核酸序列。116.根据权利要求111、113或114中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述JeT启动子包含SEQ ID NO:67的核酸序列。117.根据权利要求111或113
‑
116中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述EF1α核心启动子包含与SEQ ID NO:72具有至少80％序列同一性的核酸序列。118.根据权利要求111或113
‑
116中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述EF1α核心启动子包含SEQ ID NO:72的核酸序列。119.根据权利要求73
‑
118中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述CAR包含信号肽，所述信号肽包含与SEQ ID NO:73具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。120.根据权利要求73
‑
118中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述CAR包含信号肽，所述信号肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。121.根据权利要求42
‑
44中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)包含与SEQ ID NO:67具有至少80％序列同一性的核酸序列的第一启动子；(b)编码所述CAR的所述核酸序列,其中所述CAR包含信号肽，所述信号肽包含与SEQ ID NO:73具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(c)任选地，包含与SEQ ID NO:70具有至少80％序列同一性的核酸序列的第一终止信号；(d)包含与SEQ ID NO:72具有至少80％序列同一性的核酸序列的第二启动子；
(e)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列，其中所述HLA
‑
E融合蛋白包含与SEQ ID NO:66具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列内，其中所述内含子序列包含与SEQ ID NO:69具有至少80％序列同一性的核酸序列，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，包含与SEQ ID NO:71具有至少80％序列同一性的核酸序列的第二终止信号；其中编码所述CAR的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。122.根据权利要求42
‑
44中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5
’
至3
’
包含：(a)包含SEQ ID NO:67的核酸序列的第一启动子；(b)编码所述CAR的所述核酸序列，其中所述CAR包含信号肽，所述信号肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；(c)任选地，包含SEQ ID NO:70的核酸序列的第一终止信号；(d)包含SEQ ID NO:72的核酸序列的第二启动子；(e)编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列，其中所述HLA
‑
E融合蛋白包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列内，其中所述内含子序列包含SEQ ID NO:69的核酸序列，并且其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，包含SEQ ID NO:71的核酸序列的第二终止信号；其中编码所述CAR的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述HLA
‑
E融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shRNAmiR的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。123.根据权利要求121或权利要求122所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒包含与SEQ ID NO:75具有至少80％序列同一性的核酸序列，其中所述盒在所述基因组中位于TCRα恒定区基因内。124.根据权利要求121或权利要求122所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒包含SEQ ID NO:75的核酸序列，其中所述盒在所述基因组中位于TCRα恒定区基因内。125.根据权利要求1
‑
124中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，所述靶蛋白的表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。126.根据权利要求1
‑
125中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述靶蛋白是β
‑
2微球蛋白、CS1、转化生长因子
‑
β受体2(TGFBR2)、Cbl原癌基因B(CBL
‑
B)、CD52、TCRα基因、TCRα恒定区基因、CD7、糖皮质激素受体(GR)、脱氧胞苷激酶(DCK)、核受体亚家族2组F成员6(NR2F6)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA
‑
4)或C
‑
C趋化因子受体5型(CCR5)。127.根据权利要求126所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述靶蛋白是β
‑
2微球蛋白。128.根据权利要求127所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，β
‑
2微球蛋
白的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。129.根据权利要求127或权利要求128所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，MHCI类分子在所述细胞表面上的表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。130.根据权利要求127
‑
129中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，所述遗传修饰的免疫细胞具有降低的同种异体性。131.根据权利要求127至130中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中：(a)所述随从链包含SEQ ID NO:17的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:18的核酸序列；(b)所述随从链包含SEQ ID NO:7的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:8的核酸序列；(c)所述随从链包含SEQ ID NO:9的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:10的核酸序列；(d)所述随从链包含SEQ ID NO:11的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:12的核酸序列；(e)所述随从链包含SEQ ID NO:13的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:14的核酸序列；或者(f)所述随从链包含SEQ ID NO:15的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:16的核酸序列。132.根据权利要求127
‑
131中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述随从链包含SEQ ID NO:17的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:18的核酸序列。133.根据权利要求127
‑
132中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:46具有至少80％序列同一性的序列。134.根据权利要求133所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含SEQ ID NO:46的序列。135.根据权利要求126所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述靶蛋白是CS1。136.根据权利要求135所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，CS1的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。137.根据权利要求135或权利要求136所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞表达对CS1具有特异性的CAR。138.根据权利要求135
‑
137中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，所述遗传修饰的免疫细胞较不容易被表达对CS1具有特异性的CAR的遗传修饰的免疫细胞误杀。139.根据权利要求135
‑
138中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中：(a)所述随从链包含SEQ ID NO:21的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:22的核酸序列；
(b)所述随从链包含SEQ ID NO:23的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:24的核酸序列；或者(c)所述随从链包含SEQ ID NO:25的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:26的核酸序列。140.根据权利要求135
‑
139中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述随从链包含SEQ ID NO:25的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:26的核酸序列。141.根据权利要求135
‑
140中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:50具有至少80％序列同一性的序列。142.根据权利要求141所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含SEQ ID NO:50的序列。143.根据权利要求126所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述靶蛋白是TGFBR2。144.根据权利要求143所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，TGFBR2的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。145.根据权利要求143或权利要求144所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，所述遗传修饰的免疫细胞对转化生长因子B1(TGFB1)的免疫抑制较不敏感。146.根据权利要求143
‑
145中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中：(a)所述随从链包含SEQ ID NO:27的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:28的核酸序列；(b)所述随从链包含SEQ ID NO:29的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:30的核酸序列；(c)所述随从链包含SEQ ID NO:31的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:32的核酸序列；(d)所述随从链包含SEQ ID NO:33的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:34的核酸序列；或者(e)所述随从链包含SEQ ID NO:35的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:36的核酸序列。147.根据权利要求143
‑
146中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述随从链包含SEQ ID NO:31的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:32的核酸序列。148.根据权利要求143
‑
147中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:53具有至少80％序列同一性的序列。149.根据权利要求148所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含SEQ ID NO:53的序列。150.根据权利要求126所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述靶蛋白是CBL
‑
B。151.根据权利要求150所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，CBL
‑
B的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。152.根据权利要求150或权利要求151所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，所述遗传修饰的免疫细胞较不易受下游信号传导蛋白降解而导致的T细胞受体(TCR)信
号传导抑制的影响。153.根据权利要求126所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述靶蛋白是CD52。154.根据权利要求153所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，CD52的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。155.根据权利要求153或权利要求154所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞对CD52抗体诱导的细胞死亡较不敏感。156.根据权利要求153
‑
155中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中：(a)所述随从链包含SEQ ID NO:37的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:38的核酸序列；或者(b)所述随从链包含SEQ ID NO:39的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:40的核酸序列。157.根据权利要求153
‑
156中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述随从链包含SEQ ID NO:37的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:38的核酸序列。158.根据权利要求153
‑
157中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:56具有至少80％序列同一性的序列。159.根据权利要求158所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含SEQ ID NO:56的序列。160.根据权利要求126所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述靶蛋白是DCK。161.根据权利要求160所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，DCK的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。162.根据权利要求160或权利要求161所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞对嘌呤核苷酸类似物在细胞增殖上的影响较不敏感。163.根据权利要求160
‑
162中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中：(a)所述随从链包含SEQ ID NO:76的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:77的核酸序列；(b)所述随从链包含SEQ ID NO:78的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:79的核酸序列；(c)所述随从链包含SEQ ID NO:80的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:81的核酸序列；(d)所述随从链包含SEQ ID NO:82的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:83的核酸序列；或者(e)所述随从链包含SEQ ID NO:84的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:85的核酸序列。164.根据权利要求160
‑
163中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述随从链包含SEQ ID NO:76的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:77的核酸序列。165.根据权利要求160
‑
164中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:86具有至少80％序列同一性的序列。
166.根据权利要求165所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含SEQ ID NO:86的序列。167.根据权利要求126所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述靶蛋白是GR。168.根据权利要求167所述的遗传修饰的免疫细胞，其中与对照细胞相比，GR的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。169.根据权利要求167或权利要求168所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述遗传修饰的免疫细胞对糖皮质激素在细胞增殖上的影响较不敏感。170.根据权利要求167
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169中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中：(a)所述随从链包含SEQ ID NO:91的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:92的核酸序列；(b)所述随从链包含SEQ ID NO:93的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:94的核酸序列；(c)所述随从链包含SEQ ID NO:95的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:96的核酸序列；(d)所述随从链包含SEQ ID NO:97的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:98的核酸序列；(e)所述随从链包含SEQ ID NO:99的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:100的核酸序列；(f)所述随从链包含SEQ ID NO:101的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:102的核酸序列；(g)所述随从链包含SEQ ID NO:103的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:104的核酸序列；(h)所述随从链包含SEQ ID NO:105的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:106的核酸序列；或者(i)所述随从链包含SEQ ID NO:107的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:108的核酸序列。171.根据权利要求167
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170中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中所述随从链包含SEQ ID NO:95的核酸序列和所述引导链包含SEQ ID NO:96的核酸序列。172.根据权利要求167
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171中任一项所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:111具有至少80％序列同一性的序列。173.根据权利要求172所述的遗传修饰的免疫细胞，其中编码所述shRNAmiR的所述核酸序列包含SEQ ID NO:111的序列。174.一种用于降低免疫细胞中内源性蛋白的表达的方法，所述方法包括将包含编码shRNAmiR的核酸序列的模板核酸引入所述免疫细胞中，其中将所述模板核酸插入所述免疫细胞的基因组中并且所述shRNAmiR被表达，并且其中所述shRNAmiR降低所述免疫细胞中内源性靶蛋白的表达。175.根据权利要求174所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞，或由其衍生的细胞。176.根据权利要求174所述的方法，其中所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：精密生物科学公司，
类型：发明
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