【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤学、分子生物学和重组核酸技术的领域。特别地，本专利技术涉及对至少两种基因型的乙肝病毒基因组内的识别序列具有特异性的工程化大范围核酸酶。此类工程化大范围核酸酶可用于治疗由乙肝病毒感染和乙肝病毒引起的肝细胞癌的方法中。通过efs-web作为文本文件提交的序列表的引用本申请包含序列表，其已经通过efs-web以ascii格式提交，并且将其全部内容按引用并入本文中。将2017年10月13日创建的所述ascii拷贝命名为p109070018wo00-seq-mjt.txt，并且大小为169,011字节。
技术介绍
1、乙肝病毒(hbv)是全世界的主要健康问题，并且超过3.5亿人是慢性携带者。hbv感染是一种严重且常见的肝脏传染病。慢性感染与发生严重肝病的风险增加相关，所述严重肝病包括肝硬化和肝细胞癌(hcc)，这是人类癌症最常见的形式之一。慢性hbv携带者中hcc的估计风险大约比未感染者高100倍。世界上大约三分之一的人口在其生命中的某一时刻受到感染，包括2.4亿至3.5亿具有慢性感染的人。每年有超过750,000人死于乙型肝炎。其中约有300,000是由于肝癌。目前可用的抗hbv药物具有局限性。例如，干扰素α给药与严重的不良反应相关。核苷类似物是抑制病毒生长的，但需要长期给药。
2、hbv基因组表现出遗传变异性，每年每个位点具有1.4-3.2×10-5个核苷酸置换的估计变异率。作为在不存在病毒聚合酶的任何校对能力的情况下核苷酸错误掺入的结果，在复制过程中出现大量病毒变体。这种变异性导致了公认的病毒亚型。hb
3、hbv是属于嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)的包膜dna病毒。它含有一个小的、部分双链的(ds)、松弛环状dna(rcdna)基因组，其通过rna中间体(前基因组rna(pgrna))的逆转录复制。hbv的环状dna基因组是不寻常的，因为dna不是完全双链的。全长链的一端与病毒dna聚合酶连接。基因组长约3020-3320个核苷酸(对于全长链)和1700-2800个核苷酸长(对于短长度链)。负义(非编码)与病毒mrna互补。
4、存在四种由基因组编码的已知基因，称为c、x、p和s。核心蛋白由基因c编码(hbcag)，并且其起始密码子前是上游框内aug起始密码子(从其产生前核心蛋白)。hbeag通过前核心蛋白的蛋白水解加工产生。dna聚合酶由基因p编码。基因s编码表面抗原(hbsag)。hbsag基因是一个长的开放阅读框，但含有三个框内“起始”(atg)密码子，其将基因分为三个区段：pre-s1、pre-s2和s。由于存在多个起始密码子，产生三个不同大小的多肽，称为大(从表面到内部的顺序：pres1/前s2/s)、中(pres2/s)和小(s)。由基因x编码的蛋白质的功能尚不完全清楚，但它与肝癌的发生有关。它刺激促进细胞生长的基因并使生长调节分子失活。
5、在细胞感染后不久，病毒dna在细胞核中发现。部分双链dna通过完成(+)有义链并从(-)有义链除去蛋白质分子和从(+)有义链除去rna的短序列成为完全双链的。从(-)有义链的末端除去非编码碱基，并重新接合末端。
6、当病毒附着于宿主细胞并被内化时，hbv生命周期开始。最近的研究已经证明了牛磺胆酸钠共转运多肽(ntcp)是hbv感染中的功能性受体。病毒粒子松弛环状dna(rcdna)递送至细胞核，其在此处修复以形成共价闭合的环状dna(cccdna)。游离型cccdna作为通过宿主rna聚合酶ii的前基因组rna(pgrna)和其他病毒mrna转录的模板。然后将转录物输出到细胞质中，在此处发生病毒蛋白的翻译。逆转录酶(rt)与pgrna结合并触发核心蛋白装配成未成熟的含rna的核衣壳。然后，未成熟的核衣壳经历成熟过程，由此pgrna通过rt逆转录以产生成熟的rcdna。嗜肝dna病毒逆转录的独特特征是rt引发的负链dna合成的启动，其导致rt与负链dna的5'末端的共价连接。
7、然后，成熟的含rcdna的核衣壳被病毒表面蛋白包裹并作为病毒粒分泌(分泌途径)，或可替换地，再循环回到细胞核以进一步扩增cccdna库(再循环途径)。肝细胞中cccdna的持久性在病毒持久性、抗病毒治疗停止后病毒复制的再激活和治疗抗性中起关键作用。
8、归巢核酸内切酶是一组天然存在的核酸酶，其识别通常在植物和真菌的基因组中发现的15-40个碱基对的切割位点。它们常常与寄生dna元件相关，如1组自剪接内含子和内含肽。它们通过在染色体中产生双链断裂而自然地促进宿主基因组中特定位置的同源重组或基因插入，这募集细胞dna修复机制(stoddard(2006)，q.rev.biophys.38：49-95)。归巢核酸内切酶通常分为四个家族：laglidadg(seq id no：2)家族、giy-yig家族、his-cys盒家族和hnh家族。这些家族的特征在于结构基序，其影响催化活性和识别序列。例如，laglidadg(seq id no：2)家族的成员的特征在于具有一个或两个保守拷贝的laglidadg(seq id no：2)基序(参见chevalier等人(2001)，nucleic acids res.29(18)：3757-3774)。具有单拷贝的laglidadg(seq id no：2)基序的laglidadg(seq id no：2)归巢核酸内切酶形成同源二聚体，而具有两个拷贝的laglidadg(seq id no：2)基序的成员被发现为单体。产生归巢核酸内切酶的方法是本领域已知的。
9、i-crei(seq id no：1)是归巢核内切酸酶的laglidadg(seq id no：2)家族的成员，其识别并切割莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体染色体中的22碱基对的识别序列。遗传选择技术已被用于改变野生型i-crei切割位点偏好(sussman等(2004)，j.mol.biol.342：31-41；chames等(2005)，nucleic acids res.33：e178；seligman等(2002)，nucleic acids res.30：3870-9，arnould等(2006)，j.mol.biol.355：443-58)。描述了合理设计单-laglidadg(seq id no：2)归巢核酸内切酶的方法，其能够全面重新设计i-crei和其他归巢核酸内切酶以靶向广泛多样的dna位点，包括哺乳动物、酵母、植物、细菌和病毒基因组中的位点(wo 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种识别和切割至少两种基因型的乙肝病毒的基因组的开放阅读框(ORF)内的识别序列的工程化大范围核酸酶，其中所述工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基结合所述识别序列的第一识别半位点并包含第一超变(HVR1)区，并且其中所述第二亚基结合所述识别序列的第二识别半位点并包含第二超变(HVR2)区。
2.权利要求1的工程化大范围核酸酶，其中所述识别序列在基因型A(SEQ ID NO:3)及基因型B(SEQ ID NO:4)、基因型C(SEQ ID NO:5)、基因型D(SEQ ID NO:6)、基因型E(SEQ IDNO:7)、基因型F(SEQ ID NO:8)和基因型G(SEQ ID NO:9)中的一种或多种的ORF内。
3.权利要求1或权利要求2的工程化大范围核酸酶，其中所述识别序列在编码选自聚合酶(P)蛋白、大表面(preS1/preS2/S)蛋白、中表面(preS2/S)蛋白和小表面(S)蛋白的蛋白质的至少一个ORF内。
4.权利要求1-3任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述识别序列包含SEQ ID NO:12。
...【技术特征摘要】
1.一种识别和切割至少两种基因型的乙肝病毒的基因组的开放阅读框(orf)内的识别序列的工程化大范围核酸酶，其中所述工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基结合所述识别序列的第一识别半位点并包含第一超变(hvr1)区，并且其中所述第二亚基结合所述识别序列的第二识别半位点并包含第二超变(hvr2)区。
2.权利要求1的工程化大范围核酸酶，其中所述识别序列在基因型a(seq id no:3)及基因型b(seq id no:4)、基因型c(seq id no:5)、基因型d(seq id no:6)、基因型e(seq idno:7)、基因型f(seq id no:8)和基因型g(seq id no:9)中的一种或多种的orf内。
3.权利要求1或权利要求2的工程化大范围核酸酶，其中所述识别序列在编码选自聚合酶(p)蛋白、大表面(pres1/pres2/s)蛋白、中表面(pres2/s)蛋白和小表面(s)蛋白的蛋白质的至少一个orf内。
4.权利要求1-3任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述识别序列包含seq id no:12。
5.权利要求4的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr1区包含与对应于seq id no:22-24任一个的残基215-270或seq id no:25-28任一个的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
6.权利要求4或权利要求5的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr1区包含对应于seq idno:22-24任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基，或对应于seq id no:25-28任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。
7.权利要求4-6任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr1区包含seq id no:22-24任一个的残基215-270或seq id no:25-28任一个的残基24-79。
8.权利要求4-7任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr2区包含与对应于seq idno:22-24任一个的残基24-79或seq id no:25-28任一个的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
9.权利要求4-8任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr2区包含对应于seq idno:22-24任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基，或对应于seq id no:25-28的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。
10.权利要求4-9任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr2区包含seq id no:22-24任一个的残基24-79或seq id no:25-28任一个的残基215-270。
11.权利要求4-10任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述第一亚基包含与seq idno:22-24任一个的残基198-344或seq id no:25-28任一个的残基7-153具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且所述第二亚基包含与seq id no:22-24任一个的残基7-153或seq id no:25-28任一个的残基198-344具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
12.权利要求4-11任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述第一亚基包含seq id no:22-24任一个的残基198-344或seq id no:25-28任一个的残基7-153。
13.权利要求4-12任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述第二亚基包含seq id no:22-24任一个的残基7-153或seq id no:25-28任一个的残基198-344。
14.权利要求4-13任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述工程化大范围核酸酶包含接头，其中所述接头共价接合所述第一亚基和所述第二亚基。
15.权利要求4-14任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述工程化大范围核酸酶包含seq id no:22-28任一个的氨基酸序列。
16.权利要求1-3任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述识别序列包含seq id no:16。
17.权利要求16的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr1区包含与seq id no:33-39任一个的残基215-270具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
18.权利要求16或权利要求17的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr1区包含对应于seqid no:33-39任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。
19.权利要求16-18任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr1区包含seq id no:33-39任一个的残基215-270。
20.权利要求16-19任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr2区包含与seq id no:33-29任一个的残基24-79具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
21.权利要求16-20任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr2区包含对应于seq idno:33-39任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。
22.权利要求16-21任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述hvr2区包含seq id no:33-39任一个的残基24-79。
23.权利要求16-22任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述第一亚基包含与seq idno:33-39任一个的残基198-344具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二亚基包含与seq id no:33-39任一个的残基7-153具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
24.权利要求16-23任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述第一亚基包含seq id no:33-39任一个的残基198-344。
25.权利要求16-24任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述第二亚基包含seq id no:33-39任一个的残基7-153。
26.权利要求16-25任一项的工程化大范围核酸酶，其中所述工程化大范围核酸酶包含接头，其中所述接头共价接合所述第一亚基和所述第二亚基。
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【专利技术属性】
技术研发人员：D·扬茨，J·J·史密斯，
申请(专利权)人：精密生物科学公司，
类型：发明
国别省市：
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