【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(crispr)。具体而言，本专利技术涉及cas效应蛋白，包含此类蛋白的融合蛋白，以及编码它们的核酸分子。本专利技术还涉及用于核酸编辑(例如，基因或基因组编辑)的复合物和组合物，其包含本专利技术的蛋白或融合蛋白，或编码它们的核酸分子。本专利技术还涉及用于核酸编辑(例如，基因或基因组编辑)的方法，其使用包含本专利技术的蛋白或融合蛋白。
技术介绍
1、成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)和crispr相关(cas)基因(统称为crispr-cas或crispr/cas系统)是古细菌和细菌中针对外来遗传元件而防御特定物种的适应性免疫系统。crispr-cas系统是一种高效且具有成本效益的基因组编辑技术，可广泛应用于原核生物和真核生物中。迄今为止，基于该系统的突出的功能上和进化上的模块性，已经对包括六型(i–vi型)两类(第1类和第2类)的crispr-cas系统进行了表征。在第2类crispr-cas系统中，crispr-cas9系统应用最为广泛，传统的crispr-cas9系统由cas9核酸酶和工程化的sgrna组成，后者负责将cas9引导至靶位点并引起双链dna断裂(dsb)，继而通过非同源末端链接(nhej)、同源重组修复(hdr)等内源性途径对断裂位点进行修复，crispr-cas9系统已被利用来进行体细胞编辑、同步多位点编辑、单碱基编辑等为生物医学研究提供了广阔的前景。
2、但是，当前的crispr-cas9系统具有多种局限性，包括较大的分子量限制其
技术实现思路
1、本专利技术的一个方面提供一种crispr-cas系统，其包含：(a)cas12m多肽，所述cas12m多肽包含与seq id no.1或5所示的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)引导rna，所述引导rna与所述cas12m多肽复合以引导所述cas12m多肽结合至靶核酸。
2、在优选的实施方式中，在所述crispr-cas系统中，所述cas12m多肽相对于seq idno.1或5所示的序列，在d473和e565中的一个或两个位置处具有氨基酸取代。在优选的实施方式中，所述cas12m多肽相对于seq id no.1或5所示的序列在d473和e565中的一个或两个被丙氨酸取代。
3、在一些实施方式中，在所述crispr-cas系统中，所述cas12m多肽相对于seq idno.1所示的序列，在k49、v284、d368和n549中的一个、两个、三个或四个位置处具有氨基酸取代。在优选的实施方式中，在所述crispr-cas系统中，所述cas12m多肽相对于seq idno.1所示的序列具有一个、两个、三个或四个选自k49e、v284a、d368n和n549t的氨基酸取代。
4、在优选的实施方式中，在所述crispr-cas系统中，所述cas12m多肽(i)包含或为seq id no.1-8中任一个所示的氨基酸序列；(ii)所述cas12m多肽是无核酸切割活性的；和/或(iii)所述cas12m多肽能够结合靶核酸。
5、在优选的实施方式中，在所述crispr-cas系统中，所述引导rna包含与所述靶核酸杂交的引导区段和与cas12m多肽结合的重复区段，并且所述引导rna不包含且不结合tracrrna。
6、在优选的实施方式中，在所述crispr-cas系统中，所述引导rna的重复区段包含seq id no.12所示的核苷酸序列或与seq id no.12所示的核苷酸序列相比具有1至10个核苷酸替换、缺失和/或插入的核苷酸序列。在优选的实施方式中，所述引导rna的重复区段包含或为seq id no.12至18任一个所示的核苷酸序列。
7、本专利技术的另一个方面提供一种融合多肽，其包含与一个或多个异源多肽融合的cas12m多肽，所述cas12m多肽包含与seq id no.1或5所示的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在优选的实施方式中，所述cas12m多肽相对于seq id no.1或5所示的序列，在d473和e565中的一个或两个位置处具有氨基酸取代，优选地，d473和e565中的一个或两个被丙氨酸取代。在一些实施方式中，所述cas12m多肽相对于seq id no.1所示的序列，在k49、v284、d368和n549中的一个、两个、三个或四个位置处具有氨基酸取代。在一些实施方式中，所述cas12m多肽相对于seq id no.1所示的序列具有一个、两个、三个或四个选自k49e、v284a、d368n和n549t的氨基酸取代。
8、在优选的实施方式中，所述融合多肽中的所述一个或多个异源多肽独立地为表位标签、核定位信号或具有以下一种或多种酶促活性：逆转录酶活性、核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、脱泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷酸化活性、sumo化活性、脱sumo化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、豆蔻酰化活性、脱豆蔻酰化活性、糖基化活性(例如来自o-glcnac转移酶)和脱糖基化活性、dna修复活性、dna损伤活性、脱氨酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光裂合酶活性和糖基化酶活。在优选的实施方式中，所述酶促活性结构域具有以下一种或多种酶促活性：脱氨酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性。在优选的实施方式中，所述一个或多个异源多肽独立地为转录阻遏结构域、转录激活结构域、脱氨酶结构域。
9、在优选的实施方式中，所述融合多肽中的所述转录激活结构域包含选自以下的酶形成的结构域：转录激活因子、组蛋白赖氨酸甲基转移酶、组蛋白赖氨酸脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶以及dna脱甲基酶；优选地，所述转录阻遏结构域包含选自以下的结构域：转录阻遏物、zim3结构域、kox1阻遏结构域、mad msin3相互作用结构域(sid)、erf阻遏物结构域(erd)、srdx阻遏结构域、组蛋白赖氨酸甲基转移酶、组蛋白赖氨酸脱甲基酶、组蛋白赖氨酸脱乙酰酶、dna甲基化酶以及外周募集元件。在优选的实施方式中，所述转录激活结构域包含vp64；p65；rta；截短的p65；截短的rta；或它们各自或之间的一个或多个的融合形式。在优选的实施方式中，所述转录阻遏结构域选自krab催化结构域、dna甲基转移酶或其组合。
10、在优选的实施方式中，所述融合多肽的结构选自：
11、nh2-[cas12m]-[转录调控结构域]-cooh；
12、nh2-[转录调控结构域]-[cas12m]-cooh；
13、nh2-[cas12m]-[转录激活本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CRISPR-Cas系统，其包含：
2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas系统，其中所述Cas12m多肽：
3.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas系统，其中：
4.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas系统，其中所述引导RNA包含与所述靶核酸杂交的引导区段和与Cas12m多肽结合的重复区段，并且所述引导RNA不包含且不结合tracrRNA。
5.根据权利要求3所述的CRISPR-Cas系统，其中所述引导RNA的重复区段包含SEQ IDNO.12所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列相比具有1至10个核苷酸替换、缺失和/或插入的核苷酸序列；优选地，其中所述引导RNA的重复区段包含或为SEQ IDNO.12至18任一个所示的核苷酸序列。
6.一种融合多肽，其包含与一个或多个异源多肽融合的Cas12m多肽，所述Cas12m多肽包含与SEQ ID NO.1或5所示的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；优选地，所述Cas12m多肽：(i)相对于SEQ IDNO.1或5所示
7.根据权利要求6所述的融合多肽，其中所述一个或多个异源多肽独立地为表位标签、核定位信号或具有以下一种或多种酶促活性：逆转录酶活性、核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、脱泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷酸化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、豆蔻酰化活性、脱豆蔻酰化活性、糖基化活性(例如来自O-GlcNAc转移酶)和脱糖基化活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光裂合酶活性和糖基化酶活；更优选地，所述酶促活性结构域具有以下一种或多种酶促活性：脱氨酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性；优选地，所述一个或多个异源多肽独立地为转录阻遏结构域、转录激活结构域、脱氨酶结构域。
8.根据权利要求7所述的融合多肽，其中所述转录激活结构域包含选自以下的酶形成的结构域：转录激活因子、组蛋白赖氨酸甲基转移酶、组蛋白赖氨酸脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶以及DNA脱甲基酶；优选地，所述转录阻遏结构域包含选自以下的结构域：转录阻遏物、ZIM3结构域、KOX1阻遏结构域、Mad mSIN3相互作用结构域(SID)、ERF阻遏物结构域(ERD)、SRDX阻遏结构域、组蛋白赖氨酸甲基转移酶、组蛋白赖氨酸脱甲基酶、组蛋白赖氨酸脱乙酰酶、DNA甲基化酶以及外周募集元件；更优选地，所述转录激活结构域包含VP64；P65；RTA；截短的P65；截短的RTA；或它们各自或之间的一个或多个的融合形式；更优选地，所述转录阻遏结构域选自KRAB催化结构域、DNA甲基转移酶或其组合。
9.根据权利要求8所述的融合多肽，其中所述融合多肽的结构选自：
10.根据权利要求7所述的融合多肽，其中所述脱氨酶结构域包括腺苷脱氨酶结构域、胞苷脱氨酶结构域或其组合；优选地，所述胞苷脱氨酶选自活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)、载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)和PmCDA1；优选地，所述腺苷脱氨酶结构域是TadA、ecTadA、saTadA、ecTadA7.10、TadA-8e、TadA8.17、TadA8.20、TadA9或其组合。
11.根据权利要求10所述的融合多肽，其中所述融合多肽的结构选自：
12.一种复合物，其包含权利要求6至11任一项所述的融合多肽以及引导RNA，所述引导RNA与所述融合多肽复合以引导所述融合多肽结合至靶核酸；优选地，所述引导RNA包含与所述靶核酸杂交的引导区段和与融合多肽结合的重复区段，并且所述引导RNA不包含且不结合tracrRNA；优选地，所述引导RNA的重复区段包含SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列或与SEQ ...
【技术特征摘要】
1.一种crispr-cas系统，其包含：
2.根据权利要求1所述的crispr-cas系统，其中所述cas12m多肽：
3.根据权利要求1所述的crispr-cas系统，其中：
4.根据权利要求1所述的crispr-cas系统，其中所述引导rna包含与所述靶核酸杂交的引导区段和与cas12m多肽结合的重复区段，并且所述引导rna不包含且不结合tracrrna。
5.根据权利要求3所述的crispr-cas系统，其中所述引导rna的重复区段包含seq idno.12所示的核苷酸序列或与seq id no.12所示的核苷酸序列相比具有1至10个核苷酸替换、缺失和/或插入的核苷酸序列；优选地，其中所述引导rna的重复区段包含或为seq idno.12至18任一个所示的核苷酸序列。
6.一种融合多肽，其包含与一个或多个异源多肽融合的cas12m多肽，所述cas12m多肽包含与seq id no.1或5所示的氨基酸序列相比具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；优选地，所述cas12m多肽：(i)相对于seq idno.1或5所示的序列，在d473和e565中的一个或两个位置处具有氨基酸取代，优选地，d473和e565中的一个或两个被丙氨酸取代；或(ii)相对于seq id no.1所示的序列，在k49、v284、d368和n549中的一个、两个、三个或四个位置处具有氨基酸取代；优选地，所述cas12m多肽具有一个、两个、三个或四个选自k49e、v284a、d368n和n549t的氨基酸取代；优选地，所述cas12m多肽包含或为seq id no.1-8中任一个所示的氨基酸序列；优选地，所述cas12m多肽是无核酸切割活性的。
7.根据权利要求6所述的融合多肽，其中所述一个或多个异源多肽独立地为表位标签、核定位信号或具有以下一种或多种酶促活性：逆转录酶活性、核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、脱泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷酸化活性、sumo化活性、脱sumo化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、豆蔻酰化活性、脱豆蔻酰化活性、糖基化活性(例如来自o-glcnac转移酶)和脱糖基化活性、dna修复活性、dna损伤活性、脱氨酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光裂合酶活性和糖基化酶活；更优选地，所述酶促活性结构域具有以下一种或多种酶促活性：脱氨酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性；优选地，所述一个或多个异源多肽独立地为转录阻遏结构域、转录激活结构域、脱氨酶结构域。
8.根据权利要求7所述的融合多肽，其中所述转录激活结构域包含选自以下的酶形成的结构域：转录激活因子、组蛋白赖氨酸甲基转移酶、组蛋白赖氨酸脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶以及dna脱甲基酶；优选地，所述转录阻遏结构域包含选自以下的结构域：转录阻遏物、zim3结构域、kox1阻遏结构域、mad msin3相互作用结构域(sid)、erf阻遏物结构域(erd)、srdx阻遏结构域、组蛋白赖氨酸甲基转移酶、组蛋白赖氨酸脱甲基酶、组蛋白赖氨酸脱乙酰酶、dna甲基化酶以及外周募集元件；更优选地，所述转录激活结构域包含vp64；p65；rta；截短的p65；截短的rta；或它们各自或之间的一个或多个的融合形式；更优选地，所述转录阻遏结构域选自krab催化结构域、dna甲基转移酶或其组合。
9.根据权利要求8所述的融合多肽，其中所述融合多肽的结构选自：
10.根据权利要求7所述的融合多肽，其中所述脱氨酶结构域包括腺苷脱氨酶结构域、胞苷脱氨酶结构域或其组合；优选地，所述胞苷脱氨酶选自活化诱导的胞苷脱氨酶(aid)、载脂蛋白b mrna编辑复合物(apobec)和pmcda1；优选地，所述腺苷脱氨酶结构域是tada、ectada、satada、ectada7.10、tada-8e、tada8.17、tada8.20、tada9或其组合。
11.根据权利要求10所述的融合多肽，其中所述融合多肽的结构选自：
12.一种复合物，其包含权利要求6至11任一项所述的融合多肽以及引导rna，所述引导rna与所述融合多肽复合以引导所述融合多肽结合至靶核酸；优选地，所述引导rna包含与所述靶核酸杂交的引导区段和与融合多肽结合的重复区段，并且所述引导rna不包含且不结合tracrrna；优选地，所述引导rna的重复区段包含seq id no.12所示的核苷酸序列或与seq id no.12所示的核苷酸序列相比具有1至10个核苷酸替换、缺失或插入的核苷酸序列；优选地，其中所述引导rna的重复区段包含或为seq id no...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈柏洪，胡洋，孙金帅，徐文倡，余嘉俊，吴幼玉，林少芸，谭文琼，余宇霖，马肖杰，
申请(专利权)人：微光基因苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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