【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一种原位分泌蛋白的肿瘤靶向性工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、癌症是威胁人类生命和健康的首要疾病。传统的肿瘤治疗手段包括手术切除、放疗和化疗，其具有较高的复发率、较低的生存率。相比之下，癌症免疫治疗则通过激活人体自身免疫系统，活化免疫细胞清除体内的癌细胞，具有精准靶向性、较低的毒副作用、和免疫记忆性等优势。
2、目前，癌症免疫治疗研究主要集中在免疫检查点抗体、嵌合抗原受体t细胞免疫疗法(car-t)等。近年来，免疫检查点治疗性抗体药物ctla-4和pd-1单克隆抗体已被fda批准用于黑色素瘤、乳腺癌等多种肿瘤的临床治疗，然而其只有部分病人对免疫检查点抗体疗法有治疗效果，其响应率低于30％，这种差异主要源于病人自身的肿瘤免疫微环境不同。而t细胞免疫疗法通常是首先通过细胞趋化因子受体如cxcl9和cxcl10等寻找到肿瘤部位，然后利用cd8+t细胞分泌inf-γ杀伤肿瘤细胞，但在杀伤的同时也会募集tregs到肿瘤组织，tregs分泌的tgf-β和il-10能直接抑制t细胞活性，并且tregs还能通过竞争性消耗il-2抑制cd8+t细胞增殖。此外，肿瘤组织及其附近的表皮细胞异常表达表皮生长因子(vegf)也会导致肿瘤血管异常，造成肿瘤组织成为低氧和缺乏营养的微环境，不利于免疫细胞的存活和增殖。
3、尽管如此，研究学者发现这种不利于免疫细胞的存活和增殖的肿瘤免疫微环境(如缺氧和部分肿瘤的局部坏死)，却成为了细菌存活的“小生境”。研究表明细菌可以通过多种途径在肿瘤部位富集，如李
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种靶向肿瘤的工程细菌及其构建方法与应用，本专利技术构建的工程细菌能够特异性靶向肿瘤部位，并在阿拉伯糖的诱导下分泌目标表达蛋白，实现抗肿瘤目的。
2、本专利技术的第一方面，提供了一种原位分泌蛋白的肿瘤靶向性工程菌，包含a1)～a4)至少一种蛋白编码基因：
3、a1)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；
4、a2)、白细胞介素-7；
5、a3)、程序性死亡受体1单抗；
6、a4)、tim-3单抗；
7、所述蛋白编码基因的n端连接信号肽。
8、根据本专利技术实施例的肿瘤靶向性工程菌，至少具有如下有益效果：本专利技术通过在单链抗体或细胞因子的蛋白序列n端引入分泌肽，使得治疗分子能够被分泌到细菌胞外发挥作用。
9、在本专利技术的一些实施方式中，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no：5所示。
10、在本专利技术的一些实施方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子编码基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；
11、和/或，所述白细胞介素-7编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示；
12、和/或，所述程序性死亡受体1单抗编码基因的核苷酸序列如seq id no：3所示；
13、和/或，所述tim-3单抗编码基因的核苷酸序列如seq id no：4所示。
14、在本专利技术的一些实施方式中，所述蛋白编码基因受缺氧启动子、水杨酸响应启动子、四环素响应启动子、辐射响应启动子中任一启动子调控表达。优选地，所述缺氧启动子包括ff+20*、hip-1、pfle、ansb中的任一种；所述水杨酸响应启动子包括psal、pm中的任一种；所述四环素响应启动子包括ptet；所述辐射响应启动子包括preca。
15、在本专利技术的一些实施方式中，所述蛋白编码基因受arabad启动子调控表达。
16、在本专利技术的一些实施方式中，所述肿瘤靶向性工程菌选自李斯特菌、梭状芽孢杆菌、大肠杆菌nissle 1917、减毒鼠伤寒沙门氏菌中的一种。优选地，所述肿瘤靶向性工程菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌。
17、在本专利技术的一些实施方式中，所述肿瘤靶向性工程菌包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-7编码基因。
18、具体的，所述肿瘤靶向性工程菌包含含有编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达盒的dna分子的至少一个拷贝，以及含有编码白细胞介素-7的表达盒的dna分子的至少一个拷贝。
19、在本专利技术的一些实施方式中，所述肿瘤靶向性工程菌包含程序性死亡受体1单抗和tim-3单抗编码基因。
20、具体的，所述肿瘤靶向性工程菌包含含有编码程序性死亡受体1单抗的表达盒的dna分子的至少一个拷贝，以及含有编码tim-3单抗的表达盒的dna分子的至少一个拷贝。
21、本专利技术的第二方面，提供了肿瘤靶向性工程菌的构建方法，包括将含第一方面所述的蛋白编码基因的重组表达载体转入宿主细胞原生质体中即得。
22、在本专利技术的一些实施方式中，所述重组表达载体为pbad载体。
23、在本专利技术的一些实施方式中，所述宿主细胞包括减毒鼠伤寒沙门氏菌。
24、在本专利技术的一些实施方式中，所述转入的方法包括生物学上可接受的直接转化法或者间接转化法。
25、具体的，所述直接转化法包括基因枪法、电击法、超声波法、显微注射法和peg-cacl2法；所述间接转化法包括dna病毒载体介导法和农杆菌介导法。
26、在本专利技术的一些实施方式中，所述肿瘤靶向性工程菌的构建方法具体包括：
27、将含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子编码基因的重组表达载体和含白细胞介素-7编码基因的重组表达载体共转化至宿主细胞原生质体中；
28、或将含程序性死亡受体1单抗编码基因的重组表达载体和含tim-3单抗编码基因的重组表达载体共转化至宿主细胞原生质体中。
29、本专利技术的第三方面，提供第一方面所述肿瘤靶向性工程菌在b1)～b6)任一项中的应用，b1)、促进骨髓来源树突状细胞成熟；
30、b2)、促进t细胞增殖；
31、b3)、制备抗细胞凋亡产品中的应用；
32、b4)、制备治疗皮下黑色素瘤产品中的应用；
33、b5)、制备治疗肺转移性黑色素瘤产品中的应用；
34、b6)、制备治疗乳腺癌产品中的应用。
35、本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。
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1.一种原位分泌蛋白的肿瘤靶向性工程菌，其特征在于，包含A1)～A4)至少一种蛋白编码基因：
2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性工程菌，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性工程菌，其特征在于，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
4.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性工程菌，其特征在于，所述蛋白编码基因受araBAD启动子调控表达。
5.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性工程菌，其特征在于，所述肿瘤靶向性工程菌选自李斯特菌、梭状芽孢杆菌、大肠杆菌Nissle 1917、减毒鼠伤寒沙门氏菌中的一种；
6.根据权利要求1～5任一种所述的肿瘤靶向性工程菌，其特征在于，所述肿瘤靶向性工程菌包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-7编码基因；
7.如权利要求6所述肿瘤靶向性工程菌的构建方法，其特征在于，包括将含所述蛋白编码的重组表达载体转入宿主细胞原生质体中即得。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述转入的方法包括生物学上可接受的直接转化法或者间接转化法。
10.如权利要求1～6任一项所述肿瘤靶向性工程菌在B1)～B6)任一项中的应用，
...【技术特征摘要】
1.一种原位分泌蛋白的肿瘤靶向性工程菌，其特征在于，包含a1)～a4)至少一种蛋白编码基因：
2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性工程菌，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.5所示。
3.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性工程菌，其特征在于，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子编码基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；
4.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性工程菌，其特征在于，所述蛋白编码基因受arabad启动子调控表达。
5.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性工程菌，其特征在于，所述肿瘤靶向性工程菌选自李斯特菌、梭状芽孢杆菌、大肠杆菌nissle 1917、减...
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