一种利用D-木糖为底物生物合成D-核糖的方法技术

技术编号：40082361 阅读：6 留言：0更新日期：2024-01-23 14:55

本发明专利技术提供了一种利用D‑木糖为底物生物合成D‑核糖的方法。涉及生物化工领域，其特征在于，以木糖为底物，以大肠杆菌为底盘细胞，通过构建3步酶级联反应，将D‑木糖转化为D‑核糖。通过筛选D‑木糖向D‑核糖3步转化途径中有活性的异构酶，分别为：D‑木糖/D‑葡萄糖异构酶(D‑XI/GI,EC 5.3.1.5)、D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶(D‑PE,EC 5.1.3.30)、醛糖‑酮糖异构酶(EC 5.3.1.‑)，利用上述3种酶构建共表达质粒，构建出产D‑核糖的工程菌BL21/pET28a(PB)N‑XylA‑CcDPE‑Bs‑L‑RhI。结果表明，菌株BL21/pET28a(PB)N‑XylA‑CcDPE‑Bs‑L‑RhI作为全细胞催化剂，可以将D‑木糖转化为D‑核糖，以50g/L D‑木糖为底物，合成了1.522g/LD‑核糖。本发明专利技术是一种替代戊糖磷酸途径生物合成D‑核糖方法，进一步的转化工艺优化有望大幅提高D‑核糖的产量和转化率。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化工领域，具体涉及一种利用d-木糖为底物生物合成d-核糖的方法。

技术介绍

1、d-核糖是一种天然产生的戊糖，在动植物细胞的新陈代谢中发挥着极其重要的作用。在医药应用领域，d-核糖是重要的药物中间体，可用于多种核酸类药物的生产，d-核糖可用于合成口服药莫努匹韦(molnupiravir)——默沙东，另外d-核糖可以作为类固醇、v d的结构类似物、前列腺素、核苷类药物的前体、萜类化合物、凝乳酶抑制因子、修饰氨基酸等的生产原料，也能够大量合成核黄素。在食品应用领域，d-核糖能够合成新型食品添加剂呈味核苷酸，呈味核苔酸可作为一种营养品,可作食品添加剂为提高身体素质提供核心物质基础。在临床营养和体育运动营养方面，d-核糖已广泛应用于临床营养(心脏病患者辅助治疗、肌纤维疼痛综合症)、抗高原缺氧等产品上。d-核糖在体育运动营养方面具有抗疲劳、耐缺氧的作用。

2、合成d-核糖的最早方法涉及酶水解，或从葡萄糖、阿拉伯糖、葡糖酸和木糖化学合成，但是这些方法存在成本高、转化率很低、纯化复杂、易造成环境污染等不足，因此没有取得太大的商业成功。接着开发了基于发酵的工艺来替代基于化学和生化的方法来商业生产d-核糖，已知几种生物，包括短青霉、爬行假单胞菌、和假丝酵母，可以自然地产生核糖。然而，由于产量低，培养这些微生物又困难，菌bl21/xyla、bl21/yixi、bl21/yigpi、bl21/goxi_02、bl21/gogpi、bl21/bsxi、bl21/bsgpi、bl21/ppxi、bl21/btdpease。通

3、(2)将上述不同来源的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因(padpease_01,seq idno:13)、(ppdpease_01,seq id no:14)、(bsdpease_01,seq id no:15)、(btdpease,seq idno:16)(godpease,seq id no:17)、(dpease,seq id no:18)、(ccdpease,seq id no:19)分别使用一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)克隆到载体pet28a(pb)-xyla的nhei位点(所用引物见表1)，得到8个重组质粒(重组质粒图如图2所示)。其中，所有途径基因的表达均由t7启动子和t7终止子控制。将重组质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)中，即得到8个重组大肠杆菌，经验证能催化d-木酮糖合成d-核酮糖的菌株为bl21/pet28a(pb)-xyla-ccdpease。

4、(3)将不同来源的醛糖异构酶编码基因：(bs-l-rhi,seq id no:1)、(cdrpi*(r133d),seq id no:2)、(pfgpi*(t85q),seq id no:3)、(yixi,seq id no:5)、(yigpi,seqid no:6)、(goxi_02,seq id no:7)、(gogpi,seq id no:8)、(bsxi,seq id no:9)、(bsgpi,seq id no:10)、(ppxi_02,seq id no:11)、(agog2gi,seq id no:12)、(btdpease,seq idno:16)分别使用一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)克隆到载体pet28a(pb)-xyla-ccdpease的nhei位点(所用引物见表1)，得到12个重组质粒(重组质粒图如图3所示)。其中，所有途径基因的表达均由t7启动子和t7终止子控制。将重组质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)中，即得到12重组大肠杆菌。上述12个重组菌株中能将d-木糖合成为d-核糖为：bl21/pet28a(pb)n-xyla-ccdpe-bs-l-rhi、bl21/pet28a(pb)n-xyla-ccdpease-cdrpi*(r133d)、bl21/pet28a(pb)n-xyla-ccdpease-pfgpi*(t85q)。

5、可选的，使用上述重组菌株bl21/pet28a(pb)n-xyla-ccdpe-bs-l-rhi、bl21/pet28a(pb)n-xyla-ccdpease-cdrpi*(r133d)、bl21/pet28a(pb)n-xyla-ccdpease-pfgpi*(t85q)。将d-木糖转化为核糖的条件为：培养重组大肠杆菌至od600＝0.6-0.8，添加终浓度为0.5mm的iptg，在25℃，200rpm条件下诱导8h。在4℃，4000rpm条件下离心收集菌体，使用灭菌的超纯水洗涤菌体去除培养基，然后使用20mm、ph为7.5的磷酸盐缓冲液(pbs)重悬菌体，即得到静息细胞，可作为全细胞催化剂用于后续反应。

6、可选的，所述的底物d-木糖的浓度为50g/l。

7、可选的，所述的转化条件为65℃反应10h。

8、相比于现有的技术，本专利技术具有以下有益效果：

9、(1)本专利技术使用廉价的原料d-木糖作为底物，大大降低了d-核糖的生产成本，适合大规模生产。

10、(2)本专利技术相比于磷酸戊糖途径生产d-核糖，反应过程单一，且不消耗能量，反应副产物少，便于后续的分离纯化。

11、(3)全细胞转化相较于酶法催化，避免了繁琐的酶的纯化步骤及辅因子等一系列问题，且反应条件温和，更加适合工业化生产。

技术实现思路

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【技术保护点】

1.一种利用D-木糖为底物生物合成D-核糖的方法。其特征在于，以木糖为底物，以大肠杆菌为底盘细胞，通过筛选不同来源的D-木糖/D-葡萄糖异构酶(D-XI/GI,EC 5.3.1.5)、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-PE,EC 5.1.3.30)、醛糖-酮糖异构酶(EC 5.3.1.-)，将D-木糖直接转化为D-核糖(反应过程如图1所示)。

2.根据权利要求1所述醛糖-酮糖异构酶(EC 5.3.1.-)具体包括:(1)不同来源的D-木糖异构酶又称D-葡萄糖异构酶(D-XI/GI,EC 5.3.1.5)；(2)来源于Bacillus subtilis 168的L-鼠李糖异构酶编码基因(Bs-L-RhI,SEQ ID NO:1)；(3)来源于Clostridium difficile关键位点突变后的D-核糖-5-磷酸酶异构酶编码基因(CdRPI*(R133D)，SEQ ID NO:2)；(4)来源于Pyrococcusfuriosus关键位点突变后的D-葡萄糖-6-磷酸异构酶编码基因(PfGPI*(T85Q),SEQ ID NO:3)。

3.根据权利要求1、

4.根据权利要求1所述不同来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-PE,EC 5.1.3.30)具体包括：(1)来源于pseudomonas aeruginosa PA01的D-PE编码基因(PaDPEase_01,SEQ IDNO:13)；(2)来源于pseudomonas putida KT2440的D-PE编码基因(PpDPEase_01,SEQ IDNO:14)；(3)来源于Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168的D-PE编码基因(BsDPEase_01,SEQ ID NO:15)；(4)来源于Bacillus thuringiensis ATCC 10792的D-PE编码基因(BtDPEase,SEQ ID NO:16)；(5)来源于Gluconobacter oXydans 621H的D-PE编码基因(GoDPEase,SEQ ID NO:17)；(6)来源于Agrobacterium tumefaciens NclM:2942D-PE编码基因(DPEase,SEQ ID NO:18)；(7)来源于Clostridium cellulolyticum H10的D-PE编码基因(CcDPEase,SEQ ID NO:19)。

5.根据权利要求1所述的D-核糖合成方法，其特征在于，以质粒pET28a(PB)N(序列如SEQ ID NO:20)为上述转化途径的表达载体，构建出含有所有途径基因的重组质粒。

6.根据权利要求1、权利要求5，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到含有所有途径基因的工程菌株。

7.根据权利要求1所述的D-核糖全细胞合成方法和权利要求6所述的重组工程菌株，其特征在于，所使用的转化条件如下：(1)在LB培养基中，培养大肠杆菌重组工程菌至OD600＝0.6-0.8，添加终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在25℃，200rpm条件下诱导基因表达8h；(2)在4℃，4000rpm条件下离心收集菌体，使用灭菌的超纯水洗涤...

【技术特征摘要】

1.一种利用d-木糖为底物生物合成d-核糖的方法。其特征在于，以木糖为底物，以大肠杆菌为底盘细胞，通过筛选不同来源的d-木糖/d-葡萄糖异构酶(d-xi/gi,ec 5.3.1.5)、d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(d-pe,ec 5.1.3.30)、醛糖-酮糖异构酶(ec 5.3.1.-)，将d-木糖直接转化为d-核糖(反应过程如图1所示)。

2.根据权利要求1所述醛糖-酮糖异构酶(ec 5.3.1.-)具体包括:(1)不同来源的d-木糖异构酶又称d-葡萄糖异构酶(d-xi/gi,ec 5.3.1.5)；(2)来源于bacillus subtilis 168的l-鼠李糖异构酶编码基因(bs-l-rhi,seq id no:1)；(3)来源于clostridium difficile关键位点突变后的d-核糖-5-磷酸酶异构酶编码基因(cdrpi*(r133d)，seq id no:2)；(4)来源于pyrococcusfuriosus关键位点突变后的d-葡萄糖-6-磷酸异构酶编码基因(pfgpi*(t85q),seq id no:3)。

3.根据权利要求1、权利要求2所述d-木糖/d-葡萄糖异构酶(d-xi/gi,ec 5.3.1.5)。主要包括：(1)来源于escherichia coli mg1655的d-xi编码基因(xyla,seq id no:4)；(2)来源于yarrowia lipolytica po1f的d-xi和d-gi分别编码基因(yixi,seq id no:5)和(yigpi,seq id no:6)；(3)来源于gluconobacter oxydans 621h的d-xi和d-gi分别编码基因(goxi_02,seq id no:7)和(gogpi,seq id no:8)；(4)来源于bacillus subtilissubsp.subtilis str.168的d-xi和d-gi分别编码基因(bsxi,seq id no:9)和(bsgpi,seqid no:10)；(5)来源于pseudomonasputida kt2440的d-xi编码基因(ppxi,seq id no:11)；(6)来源于bacillus thuringiensis atcc 10792的d-pe又称(d-xi)编码基因(btdpease,seq id no:16)；(7)来源于anoxybacillus gonensis g2t的d-gi编码基因(agog2gi,seqid no:12)。

4.根据权利要求1所述不同来源的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(d-pe,ec 5.1.3.30)具体包括：(1)来源于pseudomonas aeruginosa pa01的d-pe编码基因(padpease_01,seq idno:13)；(2)来源于pseudomonas putida kt2440的d-pe编码基因(ppdpease_01,seq idno:14)；(3)来源于bacillus subtilis subsp.subtilis str.168的d-pe编码基因(bsdpease_01,seq id no:15)；(4)来源于bacillus thuringiensis atcc 10...

【专利技术属性】
技术研发人员：许敬亮，吕永坤，董寒玉，赵安琪，熊文龙，张申，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：

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