【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种植物多基因编辑系统及其组装方法。
技术介绍
1、基因功能的鉴定和作物新品种的选育离不开突变体的获得。以往突变的获得方式是随机的，大大限制了突变体的使用。基因编辑技术能够在研究者需要的特定位点进行定点突变，从而加快基础研究和应用研究。
2、crispr/cas9系统是目前应用最广的基因编辑系统。天然的crispr/cas9免疫系统中需要1个cas9蛋白和2个可互补的rna元件，即tracrrna和crrna，cas9蛋白可通过crrna识别dna上与之互补的序列。cas9识别dna后，其核酸酶活性可以从pam(proto-spaceradjacent motif)序列上游的第4位碱基切割，形成平端的dna双链断裂(doublestrandbreak,dsb)。只要细胞中表达了cas9蛋白和相应的sgrna，且有该cas9蛋白能识别的pam序列，就能对基因组的任意位置进行切割。dsb可激发编辑受体自身的dna修复系统，包括非同源末端连接(non-homologousend joining,nhej)修复和同源重组(homologousrecombination,hr)修复。nhej途径不够精确，可带来多种方式的变异，引起基因功能的丧失。cas9蛋白是rna引导的核酸酶，这一特性特别有利于多基因编辑，因为增加靶点只需增加相应的sgrna即可。多靶点碱基编辑能够拓宽编辑窗口，带来类型更加多样化的人工变异。
3、对多靶点基因编辑来说，可用多转录元件系统(multicomponentt
4、以上最常用的多靶点基因编辑系统的极限为8个靶点(一般5个以上成功率低)，限制了使用范围。虽然也有升级更新，如刘耀光团队报道的水稻截短型启动子增加该团队多基因编辑系统的靶点上限，但最多也只能达到20个(一般12个以上成功率低)。此外，目前多靶点基因编辑系统构建操作繁琐耗时。pcr构建sgrna表达盒需要做2步融合pcr，一次只能构1个模块；golden gate precloned需要等待菌落生长，如戚益平系统构成需8天，且靶点数锁定。mctu系统使用常规启动子(ii型)如ubi驱动sgrna串联的单转录本的转录，但单个转录本所包含的靶点数是有限的(上限是12个，一般5个)，且因靶点要预先组装到转录元件中，工作量相比mctu减少有限。进一步增加靶点数的方案是多级golden gate克隆或goldengate克隆结合gibson克隆，均有效率低、耗时久的问题和载体过大导致成功率低等问题。因此，简单高效的高效植物多基因编辑系统及其组装方法，对促进并加快大基因家族成员、功能冗余基因、生化通路相关基因、多倍体基因组学等基因工程和生物学的应用十分必要。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种简单高效的植物多基因编辑系统。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种多基因编辑系统，包括模板载体、供体载体组和接受载体；
4、所述模板载体是具有1个以上的名称为sgrna支架-snrna启动子的dna片段的载体，所述sgrna支架-snrna启动子由sgrna支架和位于所述sgrna支架下游的snrna启动子连接而成；
5、所述供体载体组为a1)～a6)中任意一种：
6、a1)包括名称为pgn1101ck、pgn1102ck、pgn1103ck和pgn1104ck的供体载体；
7、a2)包括名称为pgn1101ck和pgn1107ck的供体载体；
8、a3)包括名称为pgn11015ck的供体载体；
9、a4)包括名称为pgn1103ck、pgn1104ck和pgn1106ck的供体载体；
10、a5)包括名称为pgn1102ck、pgn1103ck、pgn1104ck和pgn1108c的供体载体；
11、a6)包括名称为pgn1107ck和pgn1108c的供体载体；
12、所述pgn1101ck、pgn1102ck、pgn1103ck、pgn1104ck、pgn1106ck、pgn1107ck和pgn1108c均包括两个gateway的重组位点，所述pgn1101ck、pgn1102ck、pgn1103ck、pgn1104ck、pgn1106ck、pgn1107ck还包括位于所述两个gateway的重组位点之间的snrna启动子、自杀基因和sgrna支架，所述pgn1108c还包括位于所述两个gateway的重组位点之间的玉米启动子，所述自杀基因和所述玉米启动子的两端具有iis型限制性核酸内切酶位点；所述pgn1101ck的两个gateway的重组位点为attl1和attr5，所述pgn1102ck的两个gateway的重组位点为attl5和attl4，所述pgn1103ck的两个gateway的重组位点为attr4和attr3，所述pgn1104ck的两个gateway的重组位点为attl3和attl2，所述pgn1105ck的两个gateway的重组位点为attl1和attl2，所述pgn1106ck的两个gateway的重组位点为attl1和attl4，所述pgn1107ck的两个gateway的重组位点为attl5和attl2，所述pgn1108c的两个gateway的重组位点为attl1和attl5；
13、所述接受载体含有gateway的重组位点attr1和attr2，cas蛋白的编码基因或cas融合蛋白的编码基因。
14、所述系统可为组合物，具体可为多个载体的组合物。所述snrna启动子为snrna(small nuclear rna,小核rn本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多基因编辑系统，其特征在于，包括模板载体、供体载体组和接受载体；
2.根据权利要求1所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述snRNA启动子为PmOsU6a、PmOsU6b、PmOsU6c、PmOsU3、POsU6a、POsU6b、POsU6c和POsU3中的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述模板载体含有3个以上所述sgRNA支架-snRNA启动子，所述模板载体中相邻的所述sgRNA支架-snRNA启动子之间的转录方向相反；不相邻的所述sgRNA支架-snRNA启动子之间的转录方向相同或相反，相同转录方向的所述sgRNA支架-snRNA启动子之间至少间隔1000bp。
4.根据权利要求3所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述的模板载体包括pGN3701A和pGN3702A；所述pGN3701A具有4个串联的所述sgRNA支架-snRNA启动子，所述sgRNA支架的核苷酸序列为SEQ ID NO.1中408-511位碱基，所述snRNA启动子为PmOsU6a、PmOsU6b、PmOsU6c和PmOsU3；
5.根据权利要求2所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述PmOsU6a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第516-738位碱基所示；所述PmOsU6b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第2437-2625位碱基所示；所述PmOsU6c的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第5538-5731位碱基所示；所述PmOsU3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第8174-8347位碱基所示。
6.根据权利要求2或5所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述POsU6a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中第4273-4715位碱基所示；所述POsU6b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中第1321-1649位碱基所示；所述POsU6c的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中第558-1295位碱基所示；所述POsU3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中第3863-4244位碱基所示。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述attL1是一条链的核苷酸序列为SEQ ID NO.3中第2024-2123位核苷酸或是SEQ ID NO.10的双链DNA片段；所述attL2是一条链的核苷酸序列为序列是SEQ ID NO.9的双链DNA片段；所述attL3是一条链的核苷酸序列为序列是SEQ ID NO.8的双链DNA片段；所述attL4是一条链的核苷酸序列为序列是SEQ ID NO.5的双链DNA片段；所述attL5是一条链的核苷酸序列为序列是SEQID NO.4的双链DNA片段；所述attR1是一条链的核苷酸序列为序列是SEQ ID NO.11的双链DNA片段；所述attR2是一条链的核苷酸序列为序列是SEQ ID NO.12的双链DNA片段；所述attR3是一条链的核苷酸序列为序列是SEQ ID NO.7的双链DNA片段；所述attR4是一条链的核苷酸序列为序列是SEQ ID NO.6的双链DNA片段；所述attR5是一条链的核苷酸序列为序列是SEQ ID NO.3中第4275-4398位核苷酸的双链DNA片段。
8.根据权利要求1或7所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述Cas融合蛋白为dSTEME-NG、pco-dCas9-3X(SRDX)或pco-dCas9-VP64；所述dSTEME-NG含有所述Cas9蛋白和碱基编辑酶，所述碱基编辑酶为胞苷脱氨酶和/或腺苷脱氨酶；所述pco-dCas9-VP64含有dCas9和具有转录激活作用的蛋白质；所述pco-dCas9-3X(SRDX)含有dCas9和具有转录抑制作用的蛋白质。
9.权利要求1～8任一项所述的多基因编辑系统的如下应用：
10.多基因编辑载体系统的组装方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种多基因编辑系统，其特征在于，包括模板载体、供体载体组和接受载体；
2.根据权利要求1所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述snrna启动子为pmosu6a、pmosu6b、pmosu6c、pmosu3、posu6a、posu6b、posu6c和posu3中的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述模板载体含有3个以上所述sgrna支架-snrna启动子，所述模板载体中相邻的所述sgrna支架-snrna启动子之间的转录方向相反；不相邻的所述sgrna支架-snrna启动子之间的转录方向相同或相反，相同转录方向的所述sgrna支架-snrna启动子之间至少间隔1000bp。
4.根据权利要求3所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述的模板载体包括pgn3701a和pgn3702a；所述pgn3701a具有4个串联的所述sgrna支架-snrna启动子，所述sgrna支架的核苷酸序列为seq id no.1中408-511位碱基，所述snrna启动子为pmosu6a、pmosu6b、pmosu6c和pmosu3；所述pgn3702a具有4个串联的sgrna支架-snrna启动子，所述sgrna支架的核苷酸序列为seq id no.2中第425-528位碱基，所述snrna启动子为posu6a、posu6b、posu6c和posu3。
5.根据权利要求2所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述pmosu6a的核苷酸序列如seq id no.1中第516-738位碱基所示；所述pmosu6b的核苷酸序列如seq id no.1中第2437-2625位碱基所示；所述pmosu6c的核苷酸序列如seq id no.1中第5538-5731位碱基所示；所述pmosu3的核苷酸序列如seq id no.1中第8174-8347位碱基所示。
6.根据权利要求2或5所述的多基因编辑系统，其特征在于，所述posu6a的核苷酸序列如seq id no.2中第4273-4715位碱基所示；所述posu6b...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔学安，吴苏亭，秦冠男，张治国，王志伟，陈国鑫，吴金霞，孙学辉，路铁刚，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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