工程化的腺苷脱氨酶及碱基编辑器制造技术

本文公开了工程化的腺苷脱氨酶、基于这些腺苷脱氨酶的碱基编辑器以及包含这些碱基编辑器的复合物。所述腺苷脱氨酶及碱基编辑器显示出良好的腺嘌呤编辑效果，实现DNA水平A

【技术实现步骤摘要】
工程化的腺苷脱氨酶及碱基编辑器


[0001]本公开涉及工程化的腺苷脱氨酶、基于这些腺苷脱氨酶的碱基编辑器以及包含这些碱基编辑器的复合物。本公开还涉及编码工程化的腺苷脱氨酶的多核苷酸、密码子优化的多核苷酸、包含这些核苷酸的载体以及包含这些载体的细胞。本公开还涉及包含所述碱基编辑器、复合物、载体或细胞的药物组合物，以及使用所述碱基编辑器、复合物、载体、细胞或药物组合物治疗疾病的方法和用途。

技术介绍

[0002]2016年，科学家首次基于CRISPR
‑
Cas9系统结合化学生物学和基因编辑的方法，开发出单碱基编辑(BE)技术，可以在不产生DNA双链断裂(double strand breaks，DsBs)的情况下精确实现单个碱基的转换，从而有效地规避了由于双链DNA断裂后非同源末端连接修复(non
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homologous end joining，NHEJ)和同源重组修复(homology directed repair,HDR)所带来的基因编辑技术的不足。随后，科学家开发出基于E.coli TadA(ecTadA)的新型单碱基编辑器——腺嘌呤单碱基编辑技术(adenine base editor，ABE)，实现了靶位点A到G和互补链的T到C的精确转换。目前，ABE系统在基础生物学和医学领域应用广泛，主要体现在以下几个方面：(1)实现非分裂细胞的精准编辑；(2)基因功能筛选；(3)提前终止密码子的创建和纠正；(4)保守功能氨基酸的鉴定；(5)剪接位点变体的创建；(6)加速单个碱基位点处的功能缺失或功能获得性研究；(7)单碱基突变引起的遗传性疾病的临床治疗及基础理论研究。
[0003]目前的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，由RNA引导的Cas蛋白与作用于单链DNA(ssDNA)的腺苷脱氨酶融合而成。当融合蛋白在引导RNA(如sgRNA)的引导下靶向基因组DNA时，腺苷脱氨酶可结合到ssDNA上，将特定位置的腺嘌呤(A)脱氨变成肌苷(I)，I在DNA水平会被当做G进行读码与复制，最终实现A
·
T碱基对至G
·
C碱基对的直接替换。目前的ABE7.10和miniABEmax，需要较长时间才能完成反应，效率都很低，运行缓慢；科学家在ABE7.10的基础上进一步改进，得到包含单个脱氨酶结构(TadA
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8e)而能同时对多个腺嘌呤进行脱氨的ABE8e。但是，目前此类能高效对多个腺嘌呤进行脱氨的腺苷脱氨酶和碱基编辑器种类较少，限制了其在商业上的应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的一个方面提供一种腺苷脱氨酶，其相对于SEQ ID NO:1所示序列在以下位点中的一个、多个或全部具有氨基酸取代：W23、Y36、P48、H51、L84、A106、D108、V109、K110、T111、D119、G122、H123、S146、F149、R152、H156、K157、E168和E169，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有约70％至约99.5％的序列同一性。
[0005]本专利技术的一个方面提供一种腺苷脱氨酶，其包含选自SEQ ID NO:2至10任一项所示的氨基酸序列或与它们各自具有至少约80％的序列同一性的氨基酸序列。
[0006]本专利技术的一个方面提供一种腺苷脱氨酶，其相对于SEQ ID NO:12所示序列在以下
位点中的一个、多个或全部具有氨基酸取代：E22、T47、L83、A105、D107、F108、T110、D118、R121、S145、F148、R151、E154、K156、V167和E168，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示序列具有约70％至约99.5％的序列同一性。
[0007]本专利技术的一个方面提供一种腺苷脱氨酶，其包含选自SEQ ID NO:13至16任一项所示的氨基酸序列或与它们各自具有至少约80％的序列同一性的氨基酸序列。
[0008]本专利技术的一个方面提供一种腺苷脱氨酶，其相对于SEQ ID NO:17所示序列在以下位点中的一个、多个或全部具有氨基酸取代：W22、Q35、P47、Y50、L83、A105、D107、E108、T110、D118、G121、H122、S145、F148、R151、E154、K155和K156，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO:17所示序列具有约70％至约99.5％的序列同一性。
[0009]本专利技术的一个方面提供一种腺苷脱氨酶，其包含选自SEQ ID NO:18至21任一项所示的氨基酸序列或与它们各自具有至少约80％的序列同一性的氨基酸序列。
[0010]本专利技术的一个方面提供一种碱基编辑器，其包含本专利技术提供的任何一种腺苷脱氨酶；以及所述碱基编辑器与引导RNA形成的复合物。
[0011]本专利技术的其他方面提供编码本专利技术提供的任何一种腺苷脱氨酶或碱基编辑器的多核苷酸；包含所述多核苷酸的载体；包含所述载体的细胞；以及包含所述碱基编辑器、所述复合物、所述载体或所述细胞的药物组合物。
[0012]本专利技术还提供了使用本专利技术提供的任何一种腺苷脱氨酶或碱基编辑器的多核苷酸；包含所述多核苷酸的载体；包含所述载体的细胞；或包含所述碱基编辑器、所述复合物、所述载体或所述细胞的药物组合物治疗疾病的方法。
[0013]本专利技术还提供了本专利技术提供的任何一种腺苷脱氨酶或碱基编辑器的多核苷酸；包含所述多核苷酸的载体；包含所述载体的细胞；或包含所述碱基编辑器、所述复合物、所述载体或所述细胞的药物组合物在制备治疗疾病中的药物中的应用。
[0014]本专利技术还提供了用于治疗疾病的本专利技术提供的任何一种腺苷脱氨酶或碱基编辑器的多核苷酸；包含所述多核苷酸的载体；包含所述载体的细胞；或包含所述碱基编辑器、所述复合物、所述载体或所述细胞的药物组合物。
附图说明
[0015]图1.通过观察大肠杆菌是否能在固体培养基上生长显示本专利技术的一些腺嘌呤碱基编辑器对ccdB基因的起始密码子的编辑效果。
[0016]图2.通过观察大肠杆菌是否能在固体培养基上生长显示本专利技术的一些腺嘌呤碱基编辑器对ccdB基因的终止密码子的编辑效果。
[0017]图3.通过测序显示本专利技术的一些腺嘌呤碱基编辑器对ccdB基因的起始密码子的编辑效果。
[0018]图4.通过测序显示本专利技术的一些腺嘌呤碱基编辑器对ccdB基因的终止密码子的编辑效果。
[0019]图5.通过测序显示本专利技术的另一些腺嘌呤碱基编辑器对ccdB基因的起始密码子的编辑效果。
[0020]图6至10显示各种腺嘌呤碱基编辑器在293T细胞中编辑HEK2基因的测序图。
[0021]图11至15显示各种腺嘌呤碱基编辑器在293T细胞中编辑p992L基因的测序图。
[0022]图16至22显示根据本专利技术的实施例构建的各种碱基编辑器质粒的结构示意图。
具体实施方式
[0023]定义
[0024]本文使用的术语“碱基编辑器(BE)”是指包含能本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.腺苷脱氨酶，其相对于SEQ ID NO:1所示序列在以下位点中的一个、多个或全部具有氨基酸取代：W23、Y36、P48、H51、L84、A106、D108、V109、K110、T111、D119、G122、H123、S146、F149、R152、H156、K157、E168和E169，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有约70％至约99.5％的序列同一性。2.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶，其中：(a)W23的取代选自：W23R、W23K和W23H；(b)Y36的取代选自：Y36L、Y36V、Y36I和Y36P；(c)P48的取代为P48A；(d)H51的取代选自：H51L、H51V、H51I和H51P；(e)L84的取代选自：L84F、L84W和L84Y；(f)A106的取代选自：A106V、A106I、A106L和A106P；(g)D108的取代为D108N；(h)V109的取代为V109S；(i)K110的取代为K110R；(j)T111的取代选自：T111R、T111K和T111H；(k)D119的取代选自：D119N、D119R和D119Q；(l)G122的取代为G122N；(m)H123的取代为H123Y；(n)S146的取代为S146C；(o)F149的取代选自：F149Y和F149H；(p)R152的取代为R152P；(q)H156的取代选自：H156F、H156W和H156Y；(r)K157的取代为K157N；(s)E168的取代为E168I；或(t)E169的取代为E169N。3.根据权利要求1或2所述的腺苷脱氨酶，其中腺苷脱氨酶包含选自SEQ ID NO:2至10任一项所示的氨基酸序列或与它们各自具有至少约80％的序列同一性的氨基酸序列。4.腺苷脱氨酶，其相对于SEQ ID NO:12所示序列在以下位点中的一个、多个或全部具有氨基酸取代：E22、T47、L83、A105、D107、F108、T110、D118、R121、S145、F148、R151、E154、K156、V167和E168，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示序列具有约70％至约99.5％的序列同一性。5.根据权利要求4所述的腺苷脱氨酶，其中：(a)E22的取代选自：E22R、E22K和E22H；(b)T47的取代为T47A；(c)L83的取代选自：L83F、L83W和L83Y；(d)A105的取代选自：A105V、A105I、A105L和A105P；(e)D107的取代为D107N；(f)F108的取代选自：F108V、F108I、F108L和F108P；(g)T110的取代选自：T110R、T110K和T110H；
(h)D118的取代位D118N；(i)R121的取代为R121N；(j)S145的取代为S145C；(k)F148的取代为F148Y；(l)R151的取代为R151P；(m)E154的取代选自：E154V、E154I、E154L和E154P；(n)K156的取代为K156N；(o)V167的取代为V167I；或(p)E168的取代为E168N。6.根据权利要求4或5所述的腺苷脱氨酶，其中腺苷脱氨酶包含选自SEQ ID NO:13至16任一项所示的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈柏洪，胡洋，余宇霖，林少芸，谭文琼，
申请(专利权)人：微光基因苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：