一种具有新的碱基编辑功能的核酸酶及编辑系统技术方案

本申请提供了一种来自思邈菌(Simiaoa sunii)的酶Ddd_SS，它可以在GC环境中有效地脱去胞苷的氨基。本申请进而提供了一种Ddd_SS的优化衍生物DdCBE。使用本申请提供的酶类可以在GC环境中进行基因编辑，从而引入疾病相关线粒体DNA(mtDNA)突变，这在现有技术中是无法实现的。现的。现的。

【技术实现步骤摘要】
一种具有新的碱基编辑功能的核酸酶及编辑系统

技术介绍

[0001]碱基编辑可以实现目标DNA序列的精确突变，有助于剖析基因和调控元件的功能、疾病建模和开发治疗疾病的药物。核DNA中的碱基编辑是通过基于聚集规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)的碱基编辑系统实现的。不幸的是，由于缺乏将导向RNA送递到线粒体的方法，CRISPR碱基编辑系统目前不适用于线粒体的DNA编辑。最近，已开发出从类转录激活物效应器(Transcription Activator Like Effector，TALE)衍生的碱基编辑器(DddA
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derived Cytosine Base Editor，DdCBE)来催化线粒体DNA中的C
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T的编辑。这些方法依赖于DddAtox，它是一种来自新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)的双链DNA编辑酶。原始的DddAtox需要严格的TC序列位点。通过噬菌体辅助进化，Mok等人进一步获得了一种DddAtox变体，可以在TC/AC/CC序列位点催化C
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T的编辑。然而，目前仍然没有适合GC序列位点的DdCBE。此外，是否在其他物种中发现双链DNA脱氨酶也不清楚。在本研究中，本专利技术人识别并设计了新的双链DNA脱氨酶同系物来解决上述问题。

技术实现思路
附图说明
[0002]图1显示了DddAtox蛋白C端序列对于其dsDNA脱氨活性具有重要作用。图1(a)：方框标示已报道的海胆(Psammechinus miliaris)组蛋白H2B.1蛋白序列中的SPKK基序和新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)DddA蛋白序列中的SPKK基序相似序列。图1(b)：野生型DddAtox(WT)、DddAtox删除SPKK基序相似序列的截短体(Delta)和在截短体的基础上融合AT
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Hook序列(AT
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Hook)的蛋白构造示意图。图1(c)：将图1(b)中所示各蛋白以不同浓度与等量底物dsDNA混合反应，通过鉴定发生脱氨反应的dsDNA占底物总量的相对比例反应蛋白脱氨活性，图中所示数据为平均值
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标准差，3次独立重复实验。图2显示了与DddAtox同源的各种dsDNA胞嘧啶脱氨酶的比较。图2(a)：DddAtox同源的各种候选dsDNA胞嘧啶脱氨酶序列特征和活性总结。#1:根据PSI
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BLAST打分从高到低排序。#2:+,标示蛋白C端含一个SPKK基序相似序列；++,标示蛋白C端含两个SPKK基序相似序列。#3:*,标示体外脱氨活性与DddAtox相当；**,标示体外脱氨活性高于DddAtox；Weak,可以鉴定到脱氨产物，但在蛋白浓度为10μM时，平均脱氨比例<5％。图2(b)：在敲除UNG的大肠杆菌过表达Ddd_SS,Ddd_Fa和DddAtox，基因组上突变胞嘧啶两侧碱基的概率图。
[0003]图3显示的是利用Ddd_SS构建线粒体碱基编辑器的结果。图3(a)：DdCBE构建示意图。图3(b)：HEK293T细胞转染ND5.1
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DdCBE，3天后线粒体DNA编辑比例：A_G1397:DddAtox
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G1397；SS_N94:Ddd_SS
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N94；A_G1333:DddAtox
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G1333；SS_N29:Ddd_SS
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N29，图中所示数据为平均值
±
标准差，3次独立重复实验。
[0004]图4显示的是Ddd_SS突变体对致病基因的编辑功能。图4(a)：两种线粒体基因突变所导致的相关疾病。图4(b)：HEK293T细胞转染ND4
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DdCBE，3天后线粒体DNA编辑比例；图4
(c)：HEK293T细胞转染ND6
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DdCBE3天后线粒体DNA编辑比例；在图4(b)和图4(c)中，灰色背景标示(a)中疾病相关位点，灰色碱基为TALE结合部分，Ddd_SS1:Ddd_SS(T26I+T77I+T110I)；Ddd_SS2:Ddd_SS(T26I)；Ddd_SS3:Ddd_SS(T77I)；Ddd_SS4:Ddd_SS(T110I)；Ddd_SS5:Ddd_SS(T77I+T110I)；Dead
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Ddd_SS5:Ddd_SS(E44A+T77I+T110I)，Ddd_SS及其突变体使用N94分裂位点，DddA及其突变体使用G1397分裂位点，图中所示数据为平均值
±
标准差，3次独立重复实验。
[0005]图5显示了DddAtox突变体拓展可编辑位点。图5(a)：用HEK293T细胞转染ND5.1
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DdCBE，3天后线粒体DNA编辑比例；图5(b)：用HEK293T细胞转染ND1
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DdCBE3天后线粒体DNA编辑比例；Ddd_SS及其突变体使用N94分裂位点，DddA及其突变体使用G1397分裂位点，图中所示数据为平均值
±
标准差，3次独立重复实验。
具体实施方式
[0006]本申请中使用的分子生物学方法，除非另有说明，均为本领域技术人员熟知的实验方法。所使用的试剂除非另有说明，均为市售常见的试剂。因此，本领域技术人员通过阅读以下说明，完全可以重复本申请的实验并得出同样的结果。
[0007]试验方法
[0008]菌株和培养条件
[0009]所有菌株均在Luria
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Bertani(LB)培养基或琼脂固体LB培养基中于37℃下生长。培养基中可以根据需要添加卡那霉素(50mg/L)、氨苄西林(100mg/L)、L
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阿拉伯糖(2g/L)和IPTG(0.5mM)。分别使用大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、BW25113Δung来构建和产生质粒、蛋白表达和候选脱氨酶的异源表达，以确定底物偏好。
[0010]质粒构建
[0011]为了构建脱氨酶表达的质粒，将Azenta Life Sciences(中国苏州)合成的脱氨酶基因和相应的免疫蛋白克隆到pCOLADuet1的MCS
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1(BamHI和NotI位点，引入N端六组氨酸标签)和MCS
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2(NdeI和XhoI位点)中。为了在大肠杆菌BW25113Δung中表达脱氨酶，将DddAtox、Ddd_SS和Ddd_Fa克隆到pBAD中的araBAD启动子的下游，将T7启动子驱动的相应免疫蛋白基因克隆到同一质粒的脱氨酶基因下游。为了组装DdCBE，使用金门克隆法从四聚体模板组装TALE阵列，然后将TALE阵列用Ndel和BamH1酶消化，并与裂解脱氨酶、UGI和其他DdCBE序列连接。本研究中的DdCBE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶，具有对线粒体内双链DNA的GC序列位点上的胞嘧啶的脱氨基活性。它是如下(a)或(b)所述的蛋白质：(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，(b)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由(a)衍生的蛋白质，且具有对线粒体内双链DNA的GC序列位点上的胞嘧啶的脱氨基活性。2.一种用于对线粒体内双链DNA的GC序列位点上的胞嘧啶进行脱氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪阳明，米黎，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：