碱基编辑器及其应用制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括DNA结合蛋白和脱氨酶，所述融合蛋白中的DNA结合蛋白为核酸酶活性失活的Cas突变蛋白。本发明专利技术通过对腺苷脱氨酶的改进，使其与DNA结合蛋白融合，能够用于靶核酸的单碱基编辑，具有广泛的应用前景。有广泛的应用前景。有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
碱基编辑器及其应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)
具体而言，本专利技术涉及一种碱基编辑工具，尤其是基于一种突变的腺苷脱氨酶实现碱基编辑。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
[0003]单碱基基因编辑工具的开发，能够在不引起DNA双链断裂的情况下实现对特定基因位点的精确修饰。基于腺苷脱氨酶的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，实现A>G(由A到G)的转化。目前，腺嘌呤碱基编辑器的应用受到腺苷脱氨酶结构域以及DNA结合蛋白有限相容性的限制，因此，本专利技术基于一种突变的腺苷脱氨酶，构建了可以单碱基编辑工具，扩展了单碱基编辑技术的应用范围，同时，提高了单碱基编辑效率。

技术实现思路

[0004]一方面，本专利技术提供了一种突变的腺苷脱氨酶。
[0005]在一个实施方式中，所述腺苷脱氨酶与亲本腺苷脱氨酶的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第95位氨基酸位点存在突变。
[0006]在一个实施方式中，所述第95位氨基酸突变为非I的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，T，C，P，H，R，S；优选，A、N、F或R。
[0007]在一个实施方式中，所述亲本腺苷脱氨酶的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。
[0008]MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYSTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRRVFNAQKKAQSSIN(SEQ ID No.1)
[0009]在一个实施方式中，所述亲本腺苷脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0010]本专利技术中，腺苷脱氨酶，又称之为腺嘌呤脱氨酶，其催化腺嘌呤或腺苷的水解脱氨基作用。本文提供的腺苷脱氨酶(例如，工程化的腺苷脱氨酶、演化的腺苷脱氨酶)可以来自任何生物体，例如细菌。
[0011]在一些实施方式中，腺苷脱氨酶是天然存在的腺苷脱氨酶，也可以是发生突变但仍具有腺苷脱氨酶活性的变体。
[0012]在一些实施方式中，腺苷脱氨酶来自原核生物。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶来
自细菌。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶来自大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
[0013]在一些实施方式中，腺苷脱氨酶是TadA脱氨酶。在一些实施方案中，TadA脱氨酶是大肠杆菌TadA脱氨酶，也可以是TadA脱氨酶的变体，例如TadA7
‑
10，例如，TadA9。
[0014]在一些实施方式中，TadA脱氨酶是大肠杆菌TadA脱氨酶(ecTadA)。在一些实施例中，TadA脱氨酶是截短的E.coli TadA脱氨酶。例如，相对于全长的ecTadA，截短的ecTadA可以缺失一个或多个N
‑
末端氨基酸。在一些实施方式中，相对于全长的ecTadA，截短的ecTadA可以缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个N末端氨基酸残基。在一些实施方式中，相对于全长的ecTadA，截短的ecTadA可以缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个C末端氨基酸残基。在一些实施方式中，ecTadA脱氨酶不包含N末端甲硫氨酸。
[0015]在优选的实施方式中，本专利技术，所述亲本腺苷脱氨酶来源于大肠杆菌。
[0016]一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含DNA结合蛋白和上述的腺苷脱氨酶。
[0017]在一个实施方式中，所述DNA结合蛋白为具有核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)结构域，所述“DNA结合蛋白”或“DNA结合蛋白结构域”是指能定位并结合特定靶DNA核苷酸序列(例如基因组的基因座)的任何蛋白质。在一个实施方式中，所述DNA结合蛋白为Cas蛋白，所述Cas蛋白选自Cas9、Cas9n、dCas9、CasX、CasY、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Cas12j、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、Cas9
‑
NG、LbCasl2a、enAsCasl2a、Cas9
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KKH、循环置换Cas9、Argonaute(Ago)结构域、SmacCas9、Spy
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macCas9、SpGas9
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NRRH、SpaCas9
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NRTH、SpaCas9
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NRCH、Cas9
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NG
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CP1041、Cas9
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NG
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VRQR、dCas12i、nCas12i及其变体。
[0018]在一个实施方式中，所述Cas蛋白为Cas12i。
[0019]在一个实施方式中，所述Cas蛋白可以天然存在的，也可以是非天然存在经过工程化改造的。
[0020]在一个实施方式中，所述Cas蛋白为核酸酶失活的Cas蛋白(dCas)。
[0021]在一个实施方式中，所述Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示(dCas12i3)。
[0022]在一个实施方式中，所述Cas蛋白的氨基酸序列相对于SEQ ID No.2所示的氨基酸序列在SEQ ID No.2第235位和第328位氨基酸位点处发生突变。即是说，所述Cas蛋白是SEQ ID No.2所示的蛋白在其第235位和第328位氨基酸位点处发生突变得到的Cas蛋白。
[0023]在一个实施方式中，所述第235本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变的腺苷脱氨酶，所述腺苷脱氨酶与亲本腺苷脱氨酶的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第95位氨基酸位点存在突变；优选的，所述第95位氨基酸突变为A、N、F或R。2.根据权利要求1所述的突变的腺苷脱氨酶，其特征在于，所述亲本腺苷脱氨酶的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性；优选的，所述亲本腺苷脱氨酶来源于大肠杆菌。3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含DNA结合蛋白和权利要求1
‑
2任一所述的腺苷脱氨酶。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述DNA结合蛋白为Cas蛋白；优选的，所述Cas蛋白选自Cas9、Cas9n、dCas9、CasX、CasY、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Cas12j、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、Cas9
‑
NG、LbCasl2a、enAsCasl2a、Cas9
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KKH、循环置换Cas9、Argonaute(Ago)结构域、SmacCas9、Spy
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macCas9、SpGas9
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NRRH、SpaCas9
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NRTH、SpaCas9
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NRCH、Cas9
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NG
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CP1041、Cas9
‑
NG
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VRQR、dCas12i、nCas12i及其变体，优选的，所述Cas蛋白为Cas12i。5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的DNA结合蛋白为核酸酶失活的Cas蛋白。6.根据权利要求3
‑
5任一所述的融合蛋白，其特征在于，所述DNA结合蛋白和腺苷脱氨酶通过接头连接。7.根据权利要求3
‑
5任一所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括核定位序列(NLS)。8.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1
‑
2任一所述的腺苷脱氨酶，或者，所述多核苷酸编码权利要求3
‑
7所述的融合蛋白。9.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求8所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。10.一种CRISPR
‑
Cas系统，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志强，陈莹，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：