【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学生物检测，涉及脑胶质瘤分型鉴定标志物，具体涉及检测idh1基因以及tert基因的启动子突变的引物探针组以及包含其的检测试剂盒。
技术介绍
1、弥漫性脑胶质瘤是中枢神经系统内最为常见的肿瘤，约占颅内肿瘤的30％，占神经上皮组织肿瘤的70％以上。该肿瘤在任何年龄均可以发病，发病高峰因部位而异，例如大脑半球的星形胶质瘤常发生在30-50岁的成人，下丘脑、小脑和脑桥的星形胶质瘤常发生于儿童和青年，占小脑胶质瘤的80％，小脑之弥漫性星形胶质瘤多发生于成人，平均年龄为24岁，多形性胶质母细胞瘤常发生于45-55岁的成人。
2、成人弥漫性脑胶质瘤主要分为：星形细胞瘤，idh突变型；少突胶质瘤，异柠檬酸脱氢酶(idh)突变和1p/19q共缺失；胶质母细胞瘤，idh野生型。研究表明，最大程度的安全切除可以改善胶质瘤病人术后症状、生活质量、无进展生存期(pfs)和总生存期(os)。目前，术中的主要干预技术一方面是针对肿瘤组织边界的研究，力求探明肿瘤组织浸润边界，以期做到肿瘤的全切，如术中导航、术中磁共振、术中荧光显影、术中超声等；另一方面是对脑功能区识别的研究，以避免术中对脑功能区的损伤，做到安全切除肿瘤，如神经电生理刺激、术中唤醒等。这些技术的单独应用或组合使用可提高胶质瘤病人的pfs和os。
3、在传统脑胶质瘤手术治疗中，外科医生很难完全切除弥漫性脑胶质瘤，胶质瘤的切除范围也一直是神经外科领域的研究热点。在精准医疗时代，针对不同分子亚型的脑胶质瘤病人进行个体化治疗是未来的趋势。第5版《世界卫生组织中枢神
4、与此同时，神经外科医生在术中需实时了解肿瘤的分子病理，及时调整手术策略，并在最大化肿瘤切除与最小化功能损伤之间取得平衡。传统的脑胶质瘤手术治疗中，神经外科医生会根据相应的影像学等报告，同时在术中通过pcr、arms或免疫组化形式进行冰冻病理切片等检测，针对不同分子亚型的脑胶质瘤病人进行个体化方案进行手术切除与治疗，但这些检测方式不仅耗时时间长，且准确度灵敏度相对较低，往往无法达到达到最大化肿瘤切除与最小化功能损伤之间取得平衡。现有常规检测技术中的优缺点汇总于下表1中：
5、表1常规分子分型检测方法优缺点汇总
6、
技术实现思路
1、本专利技术依托上述研究进行，针对当前术中脑胶质瘤检测时间长的缺陷，提供了一种用于术中脑胶质瘤快速提取、分型鉴定的探针引物组及检测试剂盒，既缩短检测时长，又提高检测效率和稳定性，提高检测灵敏度。
2、本专利技术的第一方面，提供了一种对脑胶质瘤进行分型鉴定的探针引物组，对人idh1基因以及tert基因的启动子突变进行检测，具有如下技术特征：包括检测人idh1r132h突变位点的idh1探针引物组以及检测人tert c228t和人tert c250t突变位点的tertc228t探针引物组和tert c250t探针引物组。
3、其中，idh1探针引物组的上下游引物序列如seq id no.1和2所示，探针序列如seqid no.3所示；所述tert c228t探针引物组的上下游引物序列如seq id no.4和5所示，探针序列如seq id no.6；
4、所述tert c250t探针引物组的上下游引物序列如seq id no.7和8所示，探针序列如seq id no.9，c250t探针引物组中的lna探针序列如seq id no.10。
5、优选的，对脑胶质瘤进行分型鉴定的探针引物组，还包括内参通用引物和探针，该内参通用上、下游引物序列如seq id no.11和12所示，内参通用探针序列如seq id no.13所示。
6、进一步优选，idh1上游引物及探针、tert c228t上游引物、tert c250t上游引物。lna修饰有助于增加pcr引物或探针的融解温度(tm值)，可显著增加对等位基因的区分能力，从而提高了杂交效率和稳定性。因此含有lna碱基的taqman探针的灵敏度更高。
7、具体的，idh1上游引物、tert c228t上游引物以及tert c250t上游引物序列中从5'端起的最后一位核苷酸进行lna修饰。
8、进一步优选，所有探针的5'端含有荧光报告基团，3'端含有荧光淬灭基团，其中，内参通用探针所连接的荧光基团与其它探针所连接的荧光基团不同。例如，idh1探针探针的5'端的荧光报告基因选用fam，3'端的荧光淬灭基团选用bhq；tert c250t探针的5'端的荧光报告基因选用fam，3'端的荧光淬灭基团选用mgb；tert c228t探针的5'端的荧光报告基因选用rox，3'端的荧光淬灭基团选用mgb；内参通用探针5'端的荧光报告基因选用vic，3'端的荧光淬灭基团选用bhq2。
9、本专利技术第二方面，提供了一种用于术中快速脑胶质瘤分型鉴定的检测试剂盒，具有如下技术特征：包括探针引物组、阳性质控品、阴性质控品以及空白对照液，还包括脑胶质瘤组织快速提取液、pcr预混液。
10、其中，探针引物组为上述所述的探针引物组；
11、阳性质控品为含有idh1、tert c228t或tert c250t突变率为1％的人类基因组dna，用于指示pcr反应体系是否有效及反应程序是否正确设置；
12、阴性质控品为10ng/μl的不含有idh1、tert c228t或tert c250t突变的人类基因组dna，用于指示pcr反应体系是否有效及反应程序是否正确设置；
13、脑胶质瘤组织快速提取液包括浓度为500mm的naoh溶液以及浓度为100mm、ph为8.0的tris-hcl溶液；脑胶质瘤组织快速提取液为江苏阔然生物医药科技有限公司研发生产，并在实验室内加以测试得到优选得到最适的脑胶质瘤组织快速提取液。
14、pcr预混液包括dna聚合酶、buffer缓冲液、甜菜碱、bsa、mg2+、dntps。pcr预混液可通过商业化渠道购买，并在实验室内加以优化与改造得到。主要酶原料为诺唯赞公司的acetaq dna polymerase(5u/μl)，货号为qn213-01或qn213-02，并对buffer缓冲液通过加入一定量的甜菜碱、bsa、mg2+,进行调配，优选得到最适的pcr预混液。
15、本专利技术第三方面，提供了一种采用上述检测试剂盒进行术中快速脑胶质瘤分型鉴定的方法，具体步骤如下：
16、a、脑胶质瘤组织dna提取
17、1脑组织切取及组织研磨
18、1)切取部分适量的待测新鲜脑组织(3mm×3mm×3mm)放入1.5毫升离心管中；
19、2)加入50微升的500mmol/l氢氧化钠溶液，并使用组织研磨棒研磨30秒钟，注本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种对脑胶质瘤进行快速分型鉴定的探针引物组，对人IDH1基因以及TERT基因的启动子突变进行检测，其特征在于，包括检测人IDH1 R132H突变位点的IDH1探针引物组以及检测人TERT C228T和人TERT C250T突变位点的TERT C228T探针引物组和TERT C250T探针引物组，
2.根据权利要求1所述的对脑胶质瘤进行快速分型鉴定的探针引物组，其特征在于，还包括内参通用引物和探针，
3.根据权利要求2所述的对脑胶质瘤进行快速分型鉴定的探针引物组，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的对脑胶质瘤进行快速分型鉴定的探针引物组，其特征在于：
5.一种用于术中脑胶质瘤快速分型鉴定的检测试剂盒，其特征在于，至少包括探针引物组、阳性质控品以及阴性质控品，
6.根据权利要求5所述的用于术中脑胶质瘤快速分型鉴定的检测试剂盒，其特征在于，还包括脑胶质瘤组织快速提取液、PCR预混液，
7.根据权利要求5所述的用于术中脑胶质瘤快速分型鉴定的检测试剂盒，其特征在于：
8.根据权利要求6所述的用于术中脑
9.根据权利要求8所述的用于术中脑胶质瘤快速分型鉴定的检测试剂盒，其特征在于：
10.根据权利要求8所述的用于术中快速脑胶质瘤分型鉴定的检测试剂盒，其特征在于：
...【技术特征摘要】
1.一种对脑胶质瘤进行快速分型鉴定的探针引物组，对人idh1基因以及tert基因的启动子突变进行检测，其特征在于，包括检测人idh1 r132h突变位点的idh1探针引物组以及检测人tert c228t和人tert c250t突变位点的tert c228t探针引物组和tert c250t探针引物组，
2.根据权利要求1所述的对脑胶质瘤进行快速分型鉴定的探针引物组，其特征在于，还包括内参通用引物和探针，
3.根据权利要求2所述的对脑胶质瘤进行快速分型鉴定的探针引物组，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的对脑胶质瘤进行快速分型鉴定的探针引物组，其特征在于：
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴林松，曹金良，张瑞，
申请(专利权)人：江苏阔然医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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