【技术实现步骤摘要】
一种CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子核心序列及其应用
[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子核心序列及其应用。
技术介绍
[0002]作为生物制药领域蛋白药物生产最主要的细胞表达体系，中国仓鼠卵巢癌细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)表达重组蛋白的产量、效率和质量成为人们关注的重点。提高蛋白产量的方法包括控制生物反应器的工艺工程及使用基因工程技术两大方面。其中，温度控制是一种简单的细胞培养过程控制参数。有研究表明，很多CHO工程细胞株的蛋白产量在亚生理低温条件(30-33℃)下的蛋白产量(Specific productivity)是在37℃条件下产量的2-5倍。然而，亚生理低温条件下细胞生长速度下降，大部分细胞滞留在G1期，导致蛋白总产量受到了限制。为提高CHO工程细胞株表达重组蛋白的产量，需要在发酵过程中低温培养的同时，通过基因工程技术提高细胞株的表达水平，并提高细胞株在长期发酵培养过程中的稳定性。
[0003]冷诱导RNA-结合蛋白(Cold Inducible RNA-binding Protein,CIRP)是一种含有172个氨基酸的高度保守的冷休克应激蛋白，在亚生理低温环境下mRNA和蛋白水平能够明显提高。真核基因的表达过程包含有多种反式作用因子(如转录因子复合物)和顺式作用元件(如启动子和增强子)的复杂相互作用。亚生理低温条件下CIRP蛋白水平的上调效应可能与其翻译起始位点上游的启动子活性提高...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子核心序列，其特征在于：所述的CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子核心序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子核心序列作为启动子直接使用或是作为其他启动子的部分序列。3.一种CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子，其特征在于：为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的CIRP-P277启动子或是核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的CIRP-P539启动子。4.权利要求3所述的CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子在蛋白表达中的应用。5.一种CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子核心序列的筛选方法，其特征在于包括如下步骤：通过生物信息学方法分析了CIRP基因翻译起始位点上游1500bp的DNA序列，选择置信度较高的基因片区作为假想启动子；设计引物，从CHO细胞基因组中分别克隆获得目标基因序列，并将目的序列亚克隆入适合的载体中使其驱动目的基因表达；将由不同假想启动子序列驱动相同目的基因表达的重组载体转入CHO细胞中进行表达，比较在37℃和32℃温度条件下不同启动子的活性，获得最优启动子序列；分析最优序列中的元件组成，获得CIRP温度敏感型启动子核心序列。6.根据权利要求5所述的CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子核心序列的筛选方法，其特征在于包括如下步骤：(1)以CIRP翻译起始位点上游1500bp的启动子区域为研究对象，生物信息学方法分析并选择置信度较高的基因片区作为假想启动子；(2)设计引物，从CHO细胞基因组中克隆出目的基因序列作为假想的启动子序列并将上述启动子序列亚克隆入表达载体中，获得分别由上述启动子驱动目的蛋白基因表达的重组表达载体；(3)通过瞬时转染方法，将步骤(2)得到的重组表达载体转入CHO细胞中进行表达；(4)将步骤(3)中获得的瞬时转染后的CHO细胞在亚生理低温环境进行培养，比较不同启动子片段在37℃和32℃温度条件下的表达活性，获得最优启动子序列；分析最优序列中的元件组成，获得CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子核心序列。7.根据权利要求6所述的CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子核心序列的筛选方法，其特征在于：步骤(1)中的生物信息学分析方法包含利用启动子分析预测软件进行分析的方法；启动子分析预测软件包含但不限于PromoterScan、Promoter 2.0、NNPP、EMBOSS Cpgplot、CpG Prediction；步骤(3)中所述的瞬时转染方法包括但不限于电击转染法、脂质体转染法、聚乙烯亚胺(PEI)转染法；所使用的宿主细胞为CHO细胞。8.根据权利要求6所述的CHO细胞内源性冷诱导RNA-结合蛋白启动子核心序列的筛选...
【专利技术属性】
技术研发人员：李靖，韦苏珍，曹春来，贺华，陈康月，
申请(专利权)人：珠海联邦制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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