【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种基于中空金免疫层析试纸条检测唾液c反应蛋白的方法。
技术介绍
1、免疫层析(immunochromatography assay，ica)是出现于20世纪80年代初期的一种新型的免疫分析方式，它是在免疫渗滤(immunofiltration assay，ifa)的基础上建立的一种简单快速的免疫学检测技术。免疫层析法的原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜的一端浸入样品(尿液、血清或唾液)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中抗原与该抗体发生特异性结合，并用免疫胶体金等材料可使该区域显示一定的颜色从而实现特异性的免疫诊断。其中免疫层析c反应蛋白(crp)的检测主要使用双抗体夹心法：首先将含有已知标记抗体的胶体金等显色试剂加入待测样品，如样品中含有目标抗原则会与标记抗体产生特异性结合，同时样品移动到试纸条上包被抗体划膜处时则会固定聚集显色，即代表阳性反应，如图1所示。
2、目前免疫层析技术中提高灵敏度是其发展最重要的一环，同时这也是胶体金比起中空金较为显著的缺点，灵敏度不高导致可信度不高、需要借助其他精密仪器等后果。但是，crp蛋白在血液中的正常值范围是0-10mg/l，而在唾液中的正常值范围则是0-1μg/l，血液和唾液中相差较大的检测限则对免疫层析试纸条的灵敏度提出了更高的要求，而市面中较为常见的胶体金试纸条则很难达到唾液检测限。
3、对于心血管疾病等来说，需要持续长期的监测相关生物标志物，以便根
4、此外，对于大多数商业侧流免疫层析(lfia)试纸条来说干法和插入法这两种加样方式最为常用，而湿法加样则较多出现在科学研究中，但是由于干法加样对于唾液等黏性溶液较难使用影响实验结果，同时湿法加样中抗体标记金溶液等所需试剂长期存放易出现降解导致实验结果出现偏差，并且特定试剂需要定量加入导致居家使用成本升高等问题。因此，迫切需要开发一种能够居家使用便捷有效并且能够长期保持产品稳定性的使用检测方法。
技术实现思路
1、为了克服传统免疫层析技术采用血液取样导致依从性较差和精密取样导致的居家使用成本较高的缺点，本专利技术提供了一种基于中空金免疫层析试纸条检测唾液c反应蛋白的方法，能够大幅提高试纸条结果的稳定性和使用期限，以实现能够在非医院等灵活场所对crp蛋白的直接检测。
2、本专利技术的目的之一是提供一种基于中空金免疫层析试纸条检测唾液c反应蛋白的方法，将待测唾液样本与抗体耦合的中空金溶液混合，然后滴加至免疫层析试纸条的样品垫上进行检测；
3、所述待测唾液样本的用量为120μl，抗体耦合的中空金溶液的用量为3.2μl；
4、所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，所述硝酸纤维素膜上设有包被c反应蛋白单克隆抗体的检测线和包被羊抗鼠抗体的质控线。
5、进一步地，所述抗体耦合的中空金溶液，其制备过程为：将2μg c反应蛋白单克隆抗体添加到1ml 0.2mg/ml中空金纳米颗粒溶液中，孵化15分钟后加入100μl 10％ bsa溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的中空金纳米颗粒离心，沉淀用50μl金标复溶液分散，4℃保存备用。
6、更进一步地，所述金标复溶液为含有3％bsa、3-5％蔗糖、3-5％海藻糖和0-1.0％tween-20的0.01m ph7.5 tris缓冲溶液。优选地，所述金标复溶液为含有3％bsa、3.5％蔗糖、3.5％海藻糖和0.8％tween-20的0.01m ph7.5 tris缓冲溶液。
7、在本专利技术的一个实施例中，可以将所述抗体耦合的中空金溶液先进行冻干，在使用前对其进行复溶后再与待测唾液样本混合。优选地，冻干条件为将冻干的样品提前放入-80℃冰箱预冻一个小时以上，随后取出在-50℃预冻干条件下冻干48h，冻干完毕干燥保存，以备使用。
8、在本专利技术的一个实施例中，考虑到居家使用时样本获取的便捷性，设计了唾液样本获取和洗脱方法用于免疫层析试纸条的测量。具体方法为：使用新棉签在口腔内部咽喉处壁上蘸取少量样本，然后放入100μl左右的洗脱液中搅拌充分直至样品基本洗脱下来，然后将含有样本的洗脱液作为待测样本使用湿法加样进行。优选的洗脱液为0.9％ nacl+0.8％吐温20。
9、本专利技术的另一目的是提供一种基于中空金检测唾液c反应蛋白的免疫层析试纸条组合，包括试纸条和标记试剂；
10、所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，硝酸纤维素膜上设有包被c反应蛋白单克隆抗体的检测线和包被羊抗鼠抗体的质控线；
11、所述标记试剂为抗体耦合的中空金溶液或抗体耦合的中空金冻干试剂。
12、进一步地，所述抗体耦合的中空金溶液，其制备过程为：将2μg c反应蛋白单克隆抗体添加到1ml 0.2mg/ml中空金纳米颗粒溶液中，孵化15分钟后加入100μl 10％ bsa溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的中空金纳米颗粒离心，沉淀用50μl金标复溶液分散，4℃保存备用。
13、进一步地，所述金标复溶液为含有3％bsa、3-5％蔗糖、3-5％海藻糖和0-1.0％tween-20的0.01m ph7.5 tris缓冲溶液。
14、进一步地，所述金标复溶液为含有3％bsa、3.5％蔗糖、3.5％海藻糖和0.8％tween-20的0.01m ph7.5 tris缓冲溶液。
15、进一步地，所述抗体耦合的中空金冻干试剂是将抗体耦合的中空金溶液进行冻干后得到。
16、本专利技术在中空金试纸条的基础上考察了三种不同加样方式的优劣，最终选择了湿法加样，并且考虑到湿法加样的问题选择冻干中空金溶液保存。然后验证了湿法加样对于真实唾液样本的结果，表明湿法加样试纸条能够成功检测真实唾液样本，避免了市面上普通试纸条检测限难以达到而采用血液检测所导致的使用不便与顺应性较差的问题。
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1.一种基于中空金免疫层析试纸条检测唾液C反应蛋白的方法，所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，硝酸纤维素膜上设有包被C反应蛋白单克隆抗体的检测线和包被羊抗鼠抗体的质控线，其特征在于，将待测唾液样本与抗体耦合的中空金溶液混合，然后滴加至免疫层析试纸条的样品垫上进行检测；
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体耦合的中空金溶液，其制备过程为：将2μg C反应蛋白单克隆抗体添加到1mL 0.2mg/ mL中空金纳米颗粒溶液中，孵化15分钟后加入100μL 10% BSA溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的中空金纳米颗粒离心，沉淀用50μL金标复溶液分散，4℃保存备用。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述金标复溶液为含有3％BSA、3-5％蔗糖、3-5％海藻糖和0-1.0％Tween-20的0.01M pH7.5 Tris缓冲溶液。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述金标复溶液为含有3％BSA、3.5％蔗糖、3.5％海藻糖和0.8
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体耦合的中空金溶液先进行冻干，在使用前对其进行复溶后再与待测唾液样本混合。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测唾液样本为唾液采样和100μL洗脱液的混合物，所述洗脱液的组成为0.9% NaCl、0.8%吐温20。
...【技术特征摘要】
1.一种基于中空金免疫层析试纸条检测唾液c反应蛋白的方法，所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，硝酸纤维素膜上设有包被c反应蛋白单克隆抗体的检测线和包被羊抗鼠抗体的质控线，其特征在于，将待测唾液样本与抗体耦合的中空金溶液混合，然后滴加至免疫层析试纸条的样品垫上进行检测；
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体耦合的中空金溶液，其制备过程为：将2μg c反应蛋白单克隆抗体添加到1ml 0.2mg/ ml中空金纳米颗粒溶液中，孵化15分钟后加入100μl 10% bsa溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的中空金纳米颗粒离心，沉淀用50μl金标复溶液分散，4℃保存备用。
【专利技术属性】
技术研发人员：沈雁，冉川江，李圣洲，施龙雨，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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