【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分析领域，特别涉及一种aav9中和抗体检测方法。
技术介绍
1、腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)是微小病毒科家族的成员之一，是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.70kb左右的线状单链dna基因组。
2、腺相关病毒9型(adeno-associated virus 9,aav9)是从非人灵长动物中分离出来的，具有免疫原性弱、安全性高、稳定表达、感染细胞类型广泛且不与靶细胞基因组整合等多重优势。aav9可介导外源基因长期有效表达，在心肌、骨骼肌、肝脏和胰腺等组织脏器中均具有较高的转导效率，现已成为基因治疗研究中的主要载体之一。研究表明，aav9还具有穿越血脑屏障并高效转导神经细胞的能力，为神经系统基因治疗开辟了新的途径。
3、中和抗体(neutralizing antibody,nab)是b淋巴细胞产生的一种能够与病原体(如病毒)表面的抗原结合，通过抑制病原体吸附、复制等过程发挥作用的一类免疫球蛋白分子，包含多克隆中和抗体和单克隆中和抗体。中和抗体具有特异性好、安全性高、作用机制明确、便于大规模生产、可同时用于预防和治疗等优点，已在许多病毒性传染病临床应用中展现出良好的治疗/预防效果。如乙型肝炎、狂犬病、破伤风等预防/治疗的免疫血清(多克隆抗体)和用于呼吸道合胞病毒感染、埃博拉病毒、新型冠状病毒等预防/治疗的单克隆抗体，均是中和抗体的典型应用。
4、中和抗体检测方法在病毒学研究、疫苗研发与
5、目前，传统的中和抗体检测方法主要有两种：空斑减少中和试验(plaque-reduction neutralization test,prnt)、细胞病变(cytopathic effect,cpe)。这两种方法均是建立在活病毒基础上，由于活毒株需要在生物安全等级高的实验室进行，且较难获得，同时，这两种方法存在检测周期长，依赖人工判读，具有主观性和操作人员依赖性的缺点，使得其应用受到了一定的限制。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种aav9中和抗体检测方法，该方法建立了一种以假病毒为基础的中和抗体检测方法，该假病毒是一种含有萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)报告基因的重组活病毒，利用中和抗体对病毒感染的抑制原理，根据稀释样品对阴性对照化学发光信号抑制率来确定待测样品的中和活性。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种aav9中和抗体检测方法，所述方法包括如下步骤：
4、s1细胞铺板
5、按照5×103～1×105个/孔活细胞数，将hek293t细胞铺板至化学发光板中，37℃、5％co2浓度培养20～24h；
6、s2病毒感染
7、使用种属血清样品稀释液分别将待测样品、阳性对照、aav9-luc稀释；
8、将稀释后的待测样品、稀释后的阳性对照、阴性对照分别和稀释后的aav9-luc等比例混合，各混合液在室温下孵育0.5～2h；
9、取s1得到的含有hek293t细胞的化学发光板，将板孔中的溶液全部吸出，分别吸取50μl混合液添加至相应板孔中，37℃、5％co2浓度培养2～8h；
10、取出化学发光板，每孔补充50μl细胞培养液，37℃、5％co2浓度继续培养16～20h；
11、阴性对照为种属血清样品稀释液；种属血清样品稀释液是通过稀释食蟹猴aav9nab阴性混合血清、比格犬aav9 nab阴性混合血清、sd大鼠aav9 nab阴性混合血清、balb/c小鼠aav9 nab阴性混合血清中的一种制备而得，稀释比例为1/5～1/20，稀释溶液为无血清样品稀释液；
12、aav9-luc是一种含有萤火虫荧光素酶报告基因的重组活病毒，具体为aav2/9-paav-cmv-luc2；
13、s3中和活性检测及判断
14、将s2得到的化学发光板取出，室温下平衡10～30min，每孔加入100μl萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂，室温下振荡孵育3～10min，检测化学发光信号；
15、计算各稀释比例的稀释样品对阴性对照化学发光信号抑制率，抑制率>50％对应的最大稀释倍数即为该待测样品的中和活性滴度值。
16、作为优选，所述细胞培养液是含有10％胎牛血清、1％glutamaxtm添加剂和1％青霉素-链霉素的dmem的混合溶液。
17、作为优选，s2中的待测样品稀释倍数为2～20000000倍。
18、作为优选，s2所述的种属指代食蟹猴、比格犬、sd大鼠、balb/c小鼠中的一种；待测样品为食蟹猴血清、比格犬血清、大鼠血清、小鼠血清中的一种。
19、作为优选，所述aav9 nab阴性混合血清通过筛选个体血清样本，选取其中确定为aav9 nab阴性的个体血清，混合后无菌过滤而得。
20、作为优选，所述无血清样品稀释液通过在495mldmem(gibco，11995065)中加入5ml青霉素-链霉素(gibco，15140122)，混合后无菌过滤而得。
21、作为优选，s2中的阳性对照工作浓度为10～500ng/ml。
22、作为优选，阳性对照是一种aav9单克隆抗体。
23、作为优选，s2中病毒感染复数(moi)为1×104～4×104。
24、与现有技术相比，本专利技术具有以下特点及有益效果：
25、1、与传统的中和抗体检测方法相比，本专利技术方法简化了操作流程，减少了孵育、固定、染色等大量耗时的步骤，可在4天内完成样品检测；
26、2、本专利技术方法以96孔化学发光板为载体进行实验操作，具有细胞和病毒使用量少，方法灵敏度高、结果判定准确度高、自动化水平高的特点，因而更加适用于大规模、高通量、标准化的血清检测。
27、3、本专利技术方法具有样品种属适用性宽的特点，食蟹猴血清、比格犬血清、sd大鼠血清、balb/c小鼠血清已经过验证，其它种属血清可能也适用于本方法。
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1.一种AAV9中和抗体检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种AAV9中和抗体检测方法，其特征在于所述细胞培养液是含有10％胎牛血清、1％GlutaMAXTM添加剂和1％青霉素-链霉素的DMEM的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的一种AAV9中和抗体检测方法，其特征在于：S2中的待测样品稀释倍数为2～20000000倍。
4.根据权利要求1所述的一种AAV9中和抗体检测方法，其特征在于：S2所述的种属指代食蟹猴、比格犬、SD大鼠、BALB/c小鼠中的一种；待测样品为食蟹猴血清、比格犬血清、大鼠血清、小鼠血清中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种AAV9中和抗体检测方法，其特征在于：所述AAV9NAb阴性混合血清通过筛选个体血清样本，选取其中确定为AAV9 NAb阴性的个体血清，混合后无菌过滤而得。
6.根据权利要求1所述的一种AAV9中和抗体检测方法，其特征在于：所述无血清样品稀释液通过在495mLDMEM中加入5mL青霉素-链霉素，混合后无菌过滤而得。
7.根据权利要
8.根据权利要求1所述的一种AAV9中和抗体检测方法，其特征在于：阳性对照是一种AAV9单克隆抗体。
9.根据权利要求1所述的一种AAV9中和抗体检测方法，其特征在于：S2中病毒感染复数(MOI)为1×104～4×104。
...【技术特征摘要】
1.一种aav9中和抗体检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种aav9中和抗体检测方法，其特征在于所述细胞培养液是含有10％胎牛血清、1％glutamaxtm添加剂和1％青霉素-链霉素的dmem的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的一种aav9中和抗体检测方法，其特征在于：s2中的待测样品稀释倍数为2～20000000倍。
4.根据权利要求1所述的一种aav9中和抗体检测方法，其特征在于：s2所述的种属指代食蟹猴、比格犬、sd大鼠、balb/c小鼠中的一种；待测样品为食蟹猴血清、比格犬血清、大鼠血清、小鼠血清中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种aav9中和抗体检测方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，操德群，胡孟军，苏春超，卢孔鑫，毛馨悦，朱向莹，
申请(专利权)人：浙江恒驭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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