伪狂犬病毒的检测引物探针组制造技术

本发明专利技术涉及疱疹病毒的标志病毒检测方法，特别涉及一种伪狂犬病毒的检测引物探针组

【技术实现步骤摘要】
伪狂犬病毒的检测引物探针组、物理滴度检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及疱疹病毒的标志病毒检测方法，特别涉及一种伪狂犬病毒的检测引物探针组
、
物理滴度检测试剂盒及检测方法
。

技术介绍

[0002]根据国内外相关法规要求的规定，生物制品生产企业需要结合产品的病毒污染来源和风险，对生产工艺过程的病毒灭活清除能力进行评价，而疱疹病毒是生物制品病毒安全性评价的一类重要病毒，伪狂犬病毒作为疱疹病毒的标志病毒，是生物制品生产工艺安全性评价中重要的组成部分，现有评价方法主要为细胞病变实验
、
动物抗体产生实验等，方法复杂
、
耗时长
、
重复性及特异性差
、
灵敏度低
。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提高检测的特异性
、
重复性
、
灵敏度和准确度，提供一种伪狂犬病毒的检测引物探针组
。
[0004]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0005]一种伪狂犬病毒的检测引物探针组，所述伪狂犬病毒的检测引物探针组包括上游引物
、
下游引物及与上游引物接近的探针，其中，
[0006]所述上游引物序列为
GCGCACCTGCTGTACTTTAT
，核苷酸序列为
SEQ ID NO.3
，
[0007]所述下游引物序列为
TACTGGCCCTCGTTGAACC<br/>，核苷酸序列为
SEQ ID NO.4
，
[0008]所述探针序列为
CGCCGGCAGCGCCCAAAGAT
，核苷酸序列为
SEQ ID NO.5
，所述探针5’
端修饰有荧光报告基团，3’
端修饰有荧光淬灭基团；
[0009]或与这些序列具有至少
95
％同源性的同功能序列
。
优选具有至少
99
％同源性的同功能序列
。
[0010]本专利技术利用基因组抽提的方法获取伪狂犬病毒的
DNA
，使用
Premix Ex Taq
和标记有荧光素的
Taqman
探针及引物与病毒
DNA
混合后，进行
PCR
反应，期间与模板
DNA
互补配对的
Taqman
探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着
PCR
循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，采用设定阈值求得
Ct
值，同时利用梯度稀释已知模版浓度的
DNA
标准品作标准曲线，即可得出待测病毒目的基因的拷贝数，经换算，即可得到其物理滴度
。
[0011]优选地，所述上游引物的长度
、
所述下游引物的长度
、
所述探针的长度独立地为
19
～
20bp。
[0012]优选地，所述上游引物的
GC
含量为
45
～
55
％，优选为
50
％
。
[0013]优选地，所述下游引物的
GC
含量为
50
～
60
％，优选为
58
％
。
[0014]优选地，所述探针的
GC
含量为
65
～
75
％，优选为
70
％
。
[0015]其中，
GC
含量是指在
DNA
的4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率
。
[0016]优选地，所述上游引物的
Tm
值为
50
～
58℃
，进一步优选为
55.7℃
；所述下游引物的
Tm
值为
50
～
58℃
，进一步优选为
56.6℃
；所述探针的
Tm
值为
63
～
67℃
，进一步优选为
65.9℃。
[0017]作为优选，所述的荧光报告基团为
FAM
；所述的荧光淬灭基团为
MGB。
[0018]作为优选，所述上游引物
、
下游引物的工作浓度为
10
μ
M
，所述探针的工作浓度为
2.5
μ
M。
[0019]一种非诊断或治疗目的伪狂犬病毒的物理滴度检测方法，该方法包括以下步骤：
[0020]S1、
以多个浓度的含有伪狂犬病毒特异性糖蛋白
gp50
基因片段的线性化质粒
DNA
标准品作为模板，采用权利要求1所述的检测引物探针组对所述质粒
DNA
模板进行荧光定量
PCR
反应，采集荧光信号后建立标准曲线；
[0021]S2、
将采集的所述荧光信号代入标准曲线生成的公式中计算，得到待测样品伪狂犬病毒的物理滴度检测结果
。
[0022]作为优选，
S1
中，质粒
DNA
标准品的构建方法是：将核苷酸序列为
SEQ ID NO.2
的伪狂犬病毒特异性糖蛋白
gp50
基因片段构建到
pUC
‑
STS(addgene
：
#35949)
载体中，得到的载体核苷酸序列为
SEQ ID NO.1
，同时为保证质粒在空间结构上尽量接近伪狂犬病毒基因组的空间结构，需要使用
XbaI
内切酶对质粒进行线性化处理
。
[0023]作为优选，
S1
中，所述荧光定量
PCR
反应的反应体系包括
10
μ
L Premix Ex Taq(Probe qPCR)2
×
、0.4
μ
L
所述上游引物
、0.4
μ
L
所述下游引物
、0.8
μ
L
所述探针
、0.1
～
0.5
μ
L DMSO、5
μ
L DNA
模板
、
无
RNA
酶水补足至
20
μ
L。DMSO
用量优选为
0.4
μ
L。
[0024]作为优选，
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种伪狂犬病毒的检测引物探针组，其特征在于：所述伪狂犬病毒的检测引物探针组包括上游引物
、
下游引物及与上游引物接近的探针，其中，所述上游引物序列为
GCGCACCTGCTGTACTTTAT
，核苷酸序列为
SEQ ID NO.3
，所述下游引物序列为
TACTGGCCCTCGTTGAACC
，核苷酸序列为
SEQ ID NO.4
，所述探针序列为
CGCCGGCAGCGCCCAAAGAT
，核苷酸序列为
SEQ ID NO.5
，所述探针5’
端修饰有荧光报告基团，3’
端修饰有荧光淬灭基团；或与这些序列具有至少
95
％同源性的同功能序列
。2.
根据权利要求1所述的伪狂犬病毒的检测引物探针组，其特征在于：所述的荧光报告基团为
FAM
；所述的荧光淬灭基团为
MGB。3.
根据权利要求1所述的伪狂犬病毒的检测引物探针组，其特征在于：所述上游引物
、
下游引物的工作浓度为
10
μ
M
，所述探针的工作浓度为
2.5
μ
M。4.
一种非诊断或治疗目的伪狂犬病毒的物理滴度检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
S1、
以多个浓度的含有伪狂犬病毒特异性糖蛋白
gp50
基因片段的质粒
DNA
标准品作为模板，采用权利要求1所述的检测引物探针组对所述质粒
DNA
模板进行荧光定量
PCR
反应，采集荧光信号后建立标准曲线；
S2、
将采集的所述荧光信号代入标准曲线生成的公式中计算，得到待测样品伪狂犬病毒的物理滴度检测结果
。5.
根据权利要求1所述的物理滴度检测方法，其特征在于：
S1
中，质粒
DNA
标准品的构建方法是：将核苷酸序列为
SEQ ID NO.2
的伪狂犬病毒特异性糖蛋白
gp50
的部分基因片段构建到
pUC
‑
STS(addgene
：
#35949)
载体中，得到的载体核苷酸序列为
SEQ ID NO.1
，同时为保证质粒在空间结构上尽...

【专利技术属性】
技术研发人员：项阳，卢孔鑫，郑成龙，毛馨悦，吴涛，朱向莹，
申请(专利权)人：浙江恒驭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：