【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抑制单增李斯特氏菌感染的稳固的g-四链体适配体，属于生物。
技术介绍
1、食源性致病微生物引起的食源性疾病是重要的公共卫生问题，也是各国食品安全的重点监测对象。单增李斯特氏菌(listeria monocytogenes，lm)，作为世界四大食源性致病菌之一，也是李斯特菌中唯一一种人畜共患病原菌，可感染免疫缺陷患者、孕妇、老人和新生儿，常见于乳制品、肉类、蔬菜等食品中。当宿主摄入含有lm的食物时，lm感染肠道并穿过肠上皮屏障进行全身传播。感染单增李斯特氏菌可引起败血症、脑膜炎和单核细胞增多症，甚至导致孕妇流产、围产期感染和胎儿死亡，是人类住院率和死亡率高(20％-30％)的原因。因此，探索抑制李斯特菌在人体内感染的方法具有重要意义。最初，单增李斯特氏菌利用两种内毒素，内毒素a(inla)和内毒素b(inlb)入侵各种类型的细胞，例如人肠上皮细胞。随后在宿主液泡中内化，单增李斯特氏菌就会利用溶血素o(llo)、磷脂酰胆碱特异性磷脂酶(pc-plc)和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶c(pi-plc)来破坏单一液泡膜，从而将细菌释放到细胞质中。在细胞质中，单增李斯特菌快速复制并产生表面肌动蛋白装配诱导(acta)蛋白。acta诱导肌动蛋白的形成，形成一个彗尾，最终将细菌推向宿主细胞表面，侵入邻近的细胞。其中，inla在入侵过程中发挥着重要作用，它通过与宿主细胞的e-钙粘蛋白(e-cadherin，e-cad)相互作用(当inla和e-cad接触时，粘附连接机制被激活)，促进李斯特菌入侵上皮细胞。如果能够阻断inla和e-ca
2、适配体是短的单链dna(ssdna)或rna序列，可折叠成独特的构象，并通过氢键、静电作用、疏水效应、π-π堆积和范德华力与目标相互作用。通常通过指数富集配体的系统进化(selex)方法制备适配体，其靶标可以是药物、蛋白质、细菌、毒素、细胞和病毒。与抗体相比，适配体合成过程快速，不会产生批次间差异。此外，适配体也更加稳定，在较宽的温度范围内具有较高的稳定性，可以长期保存。适配体也很容易被化学基团修饰固定或标记，以满足不同的诊断和治疗目的，而且合成成本比抗体低得多，更经济。这些诱人的特性赋予了适配体在分析领域的广泛应用。
3、迄今为止，基于适配体的传感器已被应用于包括环境监测、食品安全、治疗性药物监测和医疗诊断等目的。此外，适配体可以阻断靶蛋白的功能，因此，它们是开发新的感染治疗方法的有希望的候选者。事实上，一些之前的研究已经报道了具有使人凝血酶失活能力的适配体，因此有可能用于血栓治疗。ruckman等人在1998年使用传统的selex程序选择的适配体对血管内皮生长因子诱导的血管通透性具有抑制作用，因此在体内成为一种潜在的血管内皮生长因子抑制剂。在食品科学领域，在许多研究中已经报道了适配体的抗菌活性。例如：适配体g9是一种针对结核分枝杆菌的治疗剂，在1μm浓度下可完全抑制细菌的ppk2蛋白。通过这一过程，它对结核分枝杆菌表现出良好的抗菌活性。另一个例子是s3适配体，它可以与金黄色葡萄球菌肠毒素a(sea)结合，是金黄色葡萄球菌致病的主要成分。它有效地中和了sea，并显著降低了细胞因子的分泌。公开号为cn101490281a的专利中公开了能够与内化素b或内化素a结合的核酸配体，但其是否具有抑制蛋白功能的效果并未评价。
4、我们选择了单增李斯特氏菌内毒素a(inla)作为靶标，旨在利用针对inla的高亲和力适配体降低单增李斯特氏菌对caco-2的黏附和侵袭。我们在此提出了一种适配体阻断策略。通过适配体与inla上介导e-cad受体结合的区域结合，抑制inla与e-cad受体的结合，从而抑制lm感染。适配体a8是一个富含g的序列，进一步的cd光谱分析证实该适配体是一种g型四叠体折叠核酸。结合分子对接和分子动力学模拟，对适配体a8进行了有针对性的碱基突变优化。新的适配体ga8具有更稳定的g-四链结构。通过各种生化和生物物理技术对该适配体进行了广泛表征。随后，进行了一系列粘附抑制实验。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种能够特异性地、高亲和力地抑制单增李斯特氏菌内毒素a和e-钙粘蛋白相互作用的核酸适配体，其能特异性抑制单增李斯特氏菌感染起始过程中对肠上皮细胞的黏附和侵袭，同时本专利技术还提供该核酸适配体的相关应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术的第一个目的是提供一种特异性结合并抑制单增李斯特氏菌的稳固的g-四链体核酸适配体，所述核酸适配体识别、结合并抑制单增李斯特菌，包括以下(a)～(c)任一：
4、(a)核苷酸序列如seq id no.7所示的核酸适配体；
5、(b)将(a)的核酸适配体进行核苷酸修饰，且具有相同功能的核酸适配体；
6、(c)将(a)或(b)的核酸适配体的一端、两端或中间连接上功能基团，且具有相同功能的核酸适配体。
7、在一种实施方式中，所述功能基团包括生物素、氨基、巯基、荧光素、酶标记、聚乙二醇、纳米材料、抗体或胆固醇中的至少一种。
8、在一种实施方式中，所述荧光素包括cy3、cy5、fam、fitc或荧光纳米微球。
9、在一种实施方式中，所述核苷酸修饰包括甲基化修饰、巯基化修饰、氨基化修饰、甲氧基修饰、氟基修饰、硫代修饰或磷酸化修饰。
10、本专利技术的第二个目的是提供所述核酸适配体在制备靶向单增李斯特菌的制剂中的应用。
11、在一种实施方式中，所述制剂包括特异性抑制单增李斯特菌的药物、特异性识别单增李斯特菌的检测试剂或分离富集单增李斯特菌的试剂。
12、本专利技术的第三个目的是提供一种治疗和/或辅助治疗单增李斯特菌感染的药物，所述药物含有所述核酸适配体，所述药物识别、结合并抑制单增李斯特菌。
13、在一种实施方式中，所述药物识别并结合单增李斯特菌的内毒素a，通过抑制内毒素a和e-钙粘蛋白的互作，特异性抑制单增李斯特氏菌对肠上皮细胞的黏附和侵袭。
14、在一种实施方式中，所述药物含有药学上可接受的载体。
15、本专利技术的第四个目的是提供一种检测单增李斯特菌的产品，所述产品含有所述核酸适配体。
16、在一种实施方式中，所述产品包括检测探针、试纸条、试剂盒或传感器。
17、本专利技术的第五个目的是提供一种检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，所述方法为使用所述核酸适配体或所述产品与样品接触。
18、在一种实施方式中，所述样品包括河水、废水、动物粪便、血液、食品或尿液。
19、本专利技术的第六个目的是提供一种提高核酸适配体亲和力的方法，所述方法为在核苷酸序列如seq id no.1所示的出发序列的基础上，将第28位的a突变为g，32位的c也突变为g。
20、在一种实施方式中，所述方法在提高核酸适配体亲和力的同时，提高核酸适配体的稳定性。...
【技术保护点】
1.一种特异性结合并抑制单增李斯特菌的稳固的G-四链体核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体识别、结合并抑制单增李斯特菌，包括以下(a)～(c)任一：
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述功能基团包括生物素、氨基、巯基、荧光素、酶标记、聚乙二醇、纳米材料、抗体或胆固醇中的至少一种；所述核苷酸修饰包括甲基化修饰、巯基化修饰、氨基化修饰、甲氧基修饰、氟基修饰、硫代修饰或磷酸化修饰。
3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述荧光素包括Cy3、Cy5、FAM、FITC或荧光纳米微球。
4.权利要求1～3任一所述核酸适配体在制备靶向单增李斯特菌的制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述制剂包括特异性抑制单增李斯特菌的药物、特异性识别单增李斯特菌的检测试剂或分离富集单增李斯特菌的试剂。
6.一种治疗和/或辅助治疗单增李斯特菌感染的药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1～3任一所述核酸适配体，所述药物识别、结合并抑制单增李斯特菌。
7.一种检测单增李斯特菌的产品，其特征在
8.一种检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1～3任一所述核酸适配体或所述产品与样品接触。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述样品包括河水、废水、动物粪便、血液、食品或尿液。
10.一种提高核酸适配体亲和力的方法，其特征在于，所述方法为在核苷酸序列如SEQID NO.1所示的出发序列的基础上，将第28位的A突变为G，32位的C也突变为G。
...【技术特征摘要】
1.一种特异性结合并抑制单增李斯特菌的稳固的g-四链体核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体识别、结合并抑制单增李斯特菌，包括以下(a)～(c)任一：
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述功能基团包括生物素、氨基、巯基、荧光素、酶标记、聚乙二醇、纳米材料、抗体或胆固醇中的至少一种；所述核苷酸修饰包括甲基化修饰、巯基化修饰、氨基化修饰、甲氧基修饰、氟基修饰、硫代修饰或磷酸化修饰。
3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述荧光素包括cy3、cy5、fam、fitc或荧光纳米微球。
4.权利要求1～3任一所述核酸适配体在制备靶向单增李斯特菌的制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述制剂包括特异性抑制单增李斯特菌的药物、特异性识别单增李斯特菌的检测试剂或分离...
【专利技术属性】
技术研发人员：段诺，陈晓婉，吴世嘉，常玉婷，叶明玥，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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