【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程和基因治疗领域，尤其涉及一种dna聚合酶过表达的杆状病毒表达载体及其在重组腺相关病毒上的应用。
技术介绍
1、腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)是细小病毒科依赖病毒属的一种单链dna病毒。它是1965年在猿猴腺病毒制剂的污染物中发现的，两年后在人体组织中也发现了aav。aav是复制缺陷的，病毒粒子的复制依赖于辅助病毒如腺病毒的共感染。
2、aav是具有二十面体衣壳的无包膜病毒，其中包含一个约4.7kb的线性单链dna基因组。aav的基因组由两个基因rep和cap组成，两侧有t形的反向末端重复序列(invertedterminal repeats,itrs)。其中cap基因编码病毒的核衣壳蛋白，rep基因编码病毒的复制酶。aav基因组的复制依赖其编码的rep蛋白和基因组上的itr序列。在保留itr的前提下，aav基因组中的rep和cap基因可以删除，放在单独的载体上，这并不影响病毒基因组的复制和包装。重组腺相关病毒(raav)与野生型aav不同的是，其中itr区域之间的序列被转基因表达盒取代。
3、因为重组腺相关病毒两个itr序列之间可以插入任何小于4.7kb的外源基因表达盒，并且腺相关病毒可以感染人类细胞并表达外源基因，因此raav可以作为基因治疗的载体工具。
4、最初人们通过带有腺病毒部分序列的辅助质粒、表达rep和cap的质粒、带有itr的质粒共转染哺乳动物细胞，成功地获得了raav颗粒。2002年首次报道了在昆虫细胞中利用重组杆状病毒
5、此后two-bac系统和one-bac系统随后被开发出来。two-bac系统是将rep和cap整合到一种杆状病毒表达载体上，因此只需要两种杆状病毒共感染昆虫细胞即可实现raav制备(mol ther.2008；16:924-930.mol ther.2009；17:1888-1896.)。one-bac系统将sf9细胞改造为可表达rep和cap的细胞系，只需要用携带itr和目的基因的单个杆状病毒感染该细胞系即可成功制备raav(proc natl acad sci.usa.2009；106:5059-5064.)。
6、上述生产raav的方法，无论哺乳动物细胞还是昆虫细胞，都存在一个问题：获得的重组腺相关病毒粒子中，有相当一部分并没有包装进去带有itr的转基因序列dna，形成了所谓的空衣壳。基因治疗策略中，aav需要将具治疗效果的基因递送至靶细胞内部，而raav空衣壳不具有核酸，无法实现raav的基因治疗应用诉求。空衣壳会造成免疫系统的巨大负担，导致免疫反应加剧。另外，空衣壳严重降低了raav的生产率，导致后期纯化的成本居高不下。所以，降低aav空衣壳的比例(空壳率)，对于基因治疗行业至关重要。
7、杆状病毒是特异感染节肢动物的双链dna病毒，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(autographa californica nucleopolyhedrovirus,acmnpv)是杆状病毒的模式种。自从1983年smith ge等首次用杆状病毒在昆虫细胞中表达人β-干扰素基因以来(mol cellbiol.1983；3:2156-65.)，由于具有低成本、高产量，而且具备各种翻译后修饰系统等优点，杆状病毒表达载体系统在科研和生产中被广泛应用。
8、杆状病毒感染昆虫细胞后，病毒基因按照不同的时相表达。在病毒感染的极晚期，多角体基因polh和p10基因高表达。利用这两个基因的启动子可以大量表达外源基因。在用杆状病毒/昆虫细胞生产raav时，就是利用这两个启动子表达cap和rep。虽然cap基因大量表达可以提供足够多的aav核衣壳，但是如果这些核衣壳不能被包装成带有dna的病毒颗粒，那么只能徒增下游纯化成本而已。
9、对于aav，复制酶rep参与病毒基因组的复制，但并不提供聚合酶功能，所需的聚合酶活性是辅助病毒和或宿主细胞提供的。针对raav生产过程中空壳率高的问题，本专利技术提出了一种解决方案，即过表达dna聚合酶，提高raav基因组dna的相对含量，达到最终降低raav空壳率的目标。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种dna聚合酶过表达的杆状病毒载体，旨在解决
技术介绍
提及的重组腺相关病毒空壳率过高的问题。
2、本专利技术第一目的提供一种dna聚合酶过表达的杆状病毒载体，所述杆状病毒表达载体含有异源(非原生)启动子控制的dna聚合酶基因。
3、本专利技术第一目的分别可以通过以下两种途径实现的，所述异源(非原生)启动子插入原生dna聚合酶基因编码区上游，藉此达到过表达dna聚合酶的目的；或者所述异源(非原生)启动子控制的另一个dna聚合酶编码序列，藉此达到过表达dna聚合酶的目的。
4、作为优选，所述异源(非原生)启动子含有taag序列。
5、另一方面，本专利技术第二目的提供了一种重组杆状病毒，所述重组杆状病毒含有异源(非原生)启动子控制的dna聚合酶基因，所述重组杆状病毒含有腺相关病毒基因编码序列。
6、本专利技术第二目的分别可以通过以下两种途径实现的，所述dna聚合酶基因如果是杆状病毒原生dna聚合酶基因，则在其编码区上游插入异源(非原生)启动子；所述dna聚合酶基因亦可为引进的异源(非原生)启动子控制的另一个dna聚合酶编码序列。也就是说，所述异源(非原生)启动子插入原生dna聚合酶基因编码区上游，藉此达到过表达dna聚合酶的目的；或者所述异源(非原生)启动子插入控制的另一个dna聚合酶编码序列，藉此达到过表达dna聚合酶的目的。
7、作为优选，所述异源(非原生)启动子含taag序列。
8、作为优选，所述病毒基因为腺相关病毒rep基因。
9、又一方面，本专利技术第三目的提供了一种生产重组腺相关病毒的方法：用一种或多种重组杆状病毒感染昆虫细胞获得重组腺相关病毒颗粒。其中至少一种所述重组杆状病毒含有非原生启动子控制的dna聚合酶基因。即，所述生产重组腺相关病毒的方法，用于感染昆虫细胞的重组杆状病毒体系中包含异源(非原生)启动子控制的dna聚合酶基因表达框和腺相关病毒相关序列。它们可以位于同一个重组杆状病毒上，也可以分别位于两个独立的重组杆状病毒上。
10、又一方面，本专利技术第四目的提供了一种重组腺相关病毒，其特征在于，用一种或多种重组杆状病毒感染昆虫细胞获得所述重组腺相关病毒，其中至少一种所述重组杆状病毒含有异源(非原生)启动子控制的dna聚合酶基因；其中至少一种所述重组杆状病毒含有腺相关病毒本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种杆状病毒表达载体，其特征在于，所述杆状病毒表达载体含有异源(非原生)启动子控制的DNA聚合酶基因。
2.根据权利要求1所述的杆状病毒表达载体，其特征在于，所述异源(非原生)启动子插入原生DNA聚合酶基因编码区上游，藉此达到过表达DNA聚合酶的目的。
3.根据权利要求1所述的杆状病毒表达载体，其特征在于，所述异源(非原生)启动子控制另一个DNA聚合酶编码序列，藉此达到过表达DNA聚合酶的目的。
4.如权利要求2或3所述的杆状病毒表达载体，其特征在于，所述异源(非原生)启动子含有TAAG序列。
5.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒含有异源(非原生)启动子控制的DNA聚合酶基因和腺相关病毒基因编码序列。
6.如权利要求5所述的杆状病毒，其特征在于，所述腺相关病毒基因为rep基因。
7.如权利要求5所述的杆状病毒，其特征在于，所述异源(非原生)启动子含有TAAG序列。
8.一种生产重组腺相关病毒的方法，其特征在于，用一种或多种重组杆状病毒感染昆虫细胞，所述重组杆状病毒至少一种含有异源
9.一种重组腺相关病毒，其特征在于，用权利要求8所述方法，即获得所述重组腺相关病毒。
...【技术特征摘要】
1.一种杆状病毒表达载体，其特征在于，所述杆状病毒表达载体含有异源(非原生)启动子控制的dna聚合酶基因。
2.根据权利要求1所述的杆状病毒表达载体，其特征在于，所述异源(非原生)启动子插入原生dna聚合酶基因编码区上游，藉此达到过表达dna聚合酶的目的。
3.根据权利要求1所述的杆状病毒表达载体，其特征在于，所述异源(非原生)启动子控制另一个dna聚合酶编码序列，藉此达到过表达dna聚合酶的目的。
4.如权利要求2或3所述的杆状病毒表达载体，其特征在于，所述异源(非原生)启动子含有taag序列。
5.一种重组杆...
【专利技术属性】
技术研发人员：许晓东，兰兰，张瑞瑞，赵阳，李思佳，南昊，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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