【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学和体外诊断，具体涉及一种抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的特异性单克隆抗体及用途。
技术介绍
1、猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)引起的一种猪易感的急性高度接触性传染性肠道疾病，其主要特征为严重的水样腹泻、呕吐、脱水、少食或不食、哺乳仔猪死亡率为100％。该病是目前危害养殖业最严重的疾病之一，每年给全球养猪业带来巨大的经济损失。pedv能够感染各个年龄段的猪，成年猪主要表现为体重下降和营养不良等，但对一周龄以内的哺乳仔猪是致死性。
2、pedv属于冠状病毒科的冠状病毒属(coronavirus)成员，是一种有囊膜的单股正链rna病毒，pedv的基因组长度约为28kb，编码至少7个开放阅读框，包括非结构蛋白(orf1a、orf1b和orf3)和结构蛋白(核衣壳蛋白(n)，膜蛋白(m)，糖基化纤突蛋白(s)和包膜蛋白(e)。其中，pedvn蛋白是一种与病毒复制、转录和组装相关的磷酸化的蛋白，在宿主免疫中具有重要的作用。已有研究报道，在pedv感染早期，宿主能够产生高水平的抗n蛋白的抗体。此外，n蛋白高度保守，因此被认为是早期诊断和疫苗研发的靶蛋白之一。
3、过去几十年以来，大量检测pedv的方法被报道。由于ped引起的临床症状与其他腹泻疾病的临床症状相似，比如传染性胃肠炎病，因此需要借助分子生物学和免疫学方法诊断该疾病。传统的pedv诊断方法都是基于实验室检测的
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本专利技术首先获得了一种与猪流行性腹泻病毒n蛋白特异性反应的单克隆抗体6c12；其次，本申请以抗猪流行性腹泻病毒n蛋白兔多抗为捕获抗体，以hrp标记的6c12单抗作为检测抗体，建立了一种基于多抗和特异性单抗检测猪流行性腹泻病毒的双抗体夹心elisa方法；所述方法可用于猪流行性腹泻病毒抗原水平监测，替代现有rt-pcr和胶体金试纸条抗原检测方法，具有高特异性，高灵敏度；相比rt-pcr法，本专利技术操作简单，不需要实验室支持，且缩短检测时间；相比胶体金试纸条检测，本专利技术成本低，且可以进行大批量抗原检测。
2、具体包括以下内容：
3、第一方面，本专利技术提供了一种抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的特异性单克隆抗体，所述单克隆抗体重链可变区cdr包括氨基酸序列如seq id no.1所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.2所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.3所示的cdr3；所述单克隆抗体轻链可变区cdr包括氨基酸序列如seq id no.4所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.5所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.6所示的cdr3。
4、优选地，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，所述单克隆抗体轻链的可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。
5、第二方面，本专利技术提供了一种核酸，所述核酸编码上述第一方面所述单克隆抗体的抗体的重链可变区和轻链可变区。
6、优选地，编码所述单克隆抗体重链可变区的基因序列如seq id no.9所示，编码所述单克隆轻链可变区的基因序列如seq id no.10所示。
7、第三方面，本专利技术提供了上述第一方面所述的单克隆抗体在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。
8、第四方面，本专利技术提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的双抗体夹心elisa试剂盒，所述试剂盒包括抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的兔多抗和酶标记的上述第一方面所述的单克隆抗体；所述抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的兔多抗为捕获抗体，所述酶标记的上述第一方面所述的单克隆抗体为检测抗体。
9、优选地，所述试剂盒还包括酶标板、封闭液、稀释液、洗涤液、显色剂、终止液。
10、优选地，所述封闭液为5％脱脂奶；
11、优选地，所述稀释液为pbs溶液；
12、优选地，所述洗涤液为pbst缓冲液。
13、优选地，所述显色剂为tmb。
14、优选地，所述终止液为2m的硫酸。
15、第五方面，本专利技术提供了上述第四方面所述的elisa试剂盒在以非疾病诊断为目的的猪流行性腹泻病毒抗原体外检测中的应用。
16、第六方面，本专利技术提供了一种非诊断为目的的检测猪流行性腹泻病毒抗原的双抗体夹心elisa方法，所述方法包括：
17、将抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的兔多抗包被到酶标板，封闭，加待测样品后孵育，洗涤酶标板，加酶标记的权利要求1所述的单克隆抗体反应，洗涤后加入显色剂显色，加终止液终止，读取450nm的吸光度，根据p/n比值，判定检测结果。
18、优选地，所述方法包括以下步骤：
19、(1)包被：用pbs将抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的兔多抗稀释至4.0μg/ml，每孔100μl横向包被到酶标板，4℃过夜；
20、(2)封闭：pbst洗涤酶标板4遍，用5％脱脂奶37℃封闭2h；
21、(3)加待测样品：洗涤后每孔加入100μl待测样品，以pedv病毒液和正常vero培养上清为阳性和阴性对照，37℃孵育1h；
22、(4)洗涤：取出酶标板，将其甩干，用pbst洗涤4次，在吸水纸上甩干；
23、(5)加酶标单抗：将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体按1：1000稀释，每孔100μl纵向加入，37℃反应1h；
24、(6)显色：洗涤后每孔加入tmb 50μl，37℃显色15min；
25、(7)终止：加入50μl 2m硫酸终止；
26、(8)结果计算及判定：读取450nm的吸光度，当检测样品od值≥0.167，且p/n≥2时，判定为阳性，否则判为阴性。
27、本专利技术的有益效果是：①本专利技术获得了一种与猪流行性腹泻病毒n蛋白特异性反应的单克隆抗体6c12；②本专利技术以抗猪流行性腹泻病毒n蛋白兔多抗为捕获抗体，以hrp标记的6c12单抗作为检测抗体，建立了一种基于多抗和特异性单抗检测猪流行性腹泻病毒的双抗体夹心elisa方法；③所述方法可用于猪流行性腹泻病毒抗原水平监测，替代现有rt-pcr和胶体金试纸条抗原检测方法，具有高特异性，高灵敏度；相比rt-pcr法，本专利技术操本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的特异性单克隆抗体，其特征在于，
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述单克隆抗体轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1或2所述单克隆抗体的抗体的重链可变区和轻链可变区。
4.如权利要求3所述的核酸，其特征在于，编码所述单克隆抗体重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述单克隆轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.10所示。
5.如权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。
6.一种检测猪流行性腹泻病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的兔多抗和酶标记的权利要求1所述的单克隆抗体；所述抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的兔多抗为捕获抗体，所述酶标记的权利要求1所述的单克隆抗体为检测抗体。
7.如权利要求6所述的检测猪流行性腹泻病毒的
8.如权利要求6或7所述的ELISA试剂盒在以非疾病诊断为目的的猪流行性腹泻病毒抗原体外检测中的应用。
9.一种非诊断为目的的检测猪流行性腹泻病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，所述方法包括：
10.如权利要求9所述的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的特异性单克隆抗体，其特征在于，
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，所述单克隆抗体轻链的可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。
3.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1或2所述单克隆抗体的抗体的重链可变区和轻链可变区。
4.如权利要求3所述的核酸，其特征在于，编码所述单克隆抗体重链可变区的基因序列如seq id no.9所示，编码所述单克隆轻链可变区的基因序列如seq id no.10所示。
5.如权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。
6.一种检测猪流行性腹泻病毒的...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖书奇，韩伟国，马志倩，李志伟，郑海学，李洋，田宏，石正旺，郑紫方，郭旭阳，冯英桐，刘霄，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心，
类型：发明
国别省市：
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