【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫医学工程，具体涉及一种顺序调控巨噬细胞免疫微环境的抗感染促骨修复制剂及其制备方法。
技术介绍
1、宿主免疫反应和抗感染都是决定生物材料修复骨缺损成败的关键因素，并且免疫系统在防御骨骼感染和维持骨骼稳态方面发挥着至关重要的作用。巨噬细胞作为一种免疫细胞，是骨损伤微环境的重要组成部分。根据表型和功能的不同，活化的巨噬细胞可分为m1型和m2型，其极化方向受所处微环境的调控。巨噬细胞不但在宿主防御、炎症反应等方面起着关键作用，因具备异质性和功能多样性等特性使其在骨损伤修复方面也极具研究价值。基于机体自身免疫体系，通过调节植入物与组织界面的巨噬细胞活动来清除细菌成为当今抗感染骨修复材料的研究热点。目前抗感染骨修复材料中涉及到巨噬细胞的调控方式包括：增强植入体周围巨噬细胞的募集、促进巨噬细胞m1表型极化和顺序引导m1→m2表型极化等。m1型巨噬细胞具有促炎作用并参与宿主防御感染特性，而m2型有助于组织修复和炎症消退功能。
2、据报道，过渡金属铜、锌、铁、钛、锰等都能调控增强巨噬细胞m1向极化，在不同细胞类型如raw264.7和j774.a1中显示出细胞因子il-6，il-1β和tnfα表达水平的升高，即促进巨噬细胞从m0到m1过渡的作用，但也有很多报道铜则能促进细胞m0至m2极化表型。可见，金属离子可对巨噬细胞活化表现出不同的作用，但在生物医学应用中仍面临金属毒性、生物相容性低、细胞代谢消融障碍、免疫调节剂窗口窄等挑战。
3、对于骨损伤修复而言，m1向过度激活，将延长炎性反应造成骨组织愈合延迟或不良
技术实现思路
1、本专利技术的技术目的在于引导骨损伤部位m1/m2巨噬细胞的免疫平衡建立最佳骨整合免疫微环境，从而提供一种顺序调控巨噬细胞免疫微环境的抗感染促骨修复制剂及其制备方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了以下一系列技术方案进行解决。
3、本专利技术的第一个目的是提供一种顺序调控巨噬细胞免疫微环境的抗感染促骨修复制剂的制备方法，其包括以下步骤：按重量百分含量计，将1-10％黄酮改性羟基磷灰石、2-10％海藻酸钠水凝胶、0.1-1％硫化氢缓释载体和79-96.9％铜磷酸三钙膏剂按比例混合均匀，加入含na2hpo4的氯化钙水溶液，搅拌均匀，冷冻干燥。
4、优选地，所述黄酮改性羟基磷灰石中，ca离子浓度范围0.1-0.5mol/l，黄酮化合物/ca摩尔比为0.002～0.01:1。
5、优选地，所述黄酮改性羟基磷灰石的制备方法包括：按ca/p摩尔比1.67将(nh4)2hpo4水溶液和黄酮化合物的水醇溶液同时逐滴滴入ca(no3)2·4h2o水溶液中，边滴边搅拌，室温下保持搅拌3-5天；然后升温至在70-90℃，并用稀氨水将ph调节并保持至10，持续恒温搅拌3-5小时，然后以10000rpm离心10分钟，去离子水反复洗涤；最后，冷冻干燥成粉末，研磨并过100-200目筛子，即得黄酮改性羟基磷灰石粉末。
6、优选地，所述黄酮为3-羟基黄酮、5-羟基黄酮、6-羟基黄酮、3,7-二羟基黄酮、白杨素或高良姜素。
7、优选地，所述海藻酸钠水凝胶的制备方法包括：将含2％(w/v)甲基丙烯酸酯化海藻酸钠及0.1％(w/v)光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(irgacure-2959)的水溶液用波长365nm、强度1.7mw/cm2的紫外线灯照射20min。
8、优选地，所述硫化氢缓释载体为gyy4137、adt-oh或ap39；所述na2hpo4的浓度为质量体积比2％。
9、优选地，所述铜磷酸三钙膏剂的制备方法包括：将磷酸三钙加入0.2mol/lcucl2·2h2o水溶液，搅拌均匀，其中固相与液相比例为1:(0.3～0.6)g/ml；所述磷酸三钙含质量分数5％无定型磷酸三钙、8％β-磷酸三钙和87％α-磷酸三钙。
10、本专利技术的第二个目的是提供上述方法制备得到的顺序调控巨噬细胞免疫微环境的抗感染促骨修复制剂。
11、优选地，所述顺序调控巨噬细胞免疫微环境为0-4周增强巨噬细胞向m1型极化，4-8周诱导其向m2型极化。
12、本专利技术的第三个目的是提供上述的顺序调控巨噬细胞免疫微环境的抗感染促骨修复制剂在促进骨修复、巨噬细胞极化、静脉内皮血管细胞增殖、成骨细胞增殖或骨髓间充质干细胞成骨分化中的应用。
13、本专利技术所述的顺序调控巨噬细胞免疫微环境的抗感染促骨修复制剂，其作用原理是铜磷酸钙骨水泥膏剂在水溶液中会快速释放铜离子，而铜离子与光交联海藻酸钠发生交联包裹磷酸三钙和黄酮改性羟基磷灰石，而硫化氢载体在溶解后后会缓释硫化氢，与凝胶层缓释的cu2+发生作用生成具有cu+、cu2+、s2-、s0的混合体系，该体系可保持稳定cu(i)增强巨噬细胞m1向极化；而后期随着黄酮羟基磷灰石的降解可持续提高巨噬细胞增殖能力则可增强m2向极化，达到顺序调控巨噬细胞发挥抗感染和促修复的作用。
14、本专利技术的优点：
15、本专利技术通过将硫化氢缓释载体和双金属装载到交联光交联海藻酸钠水凝胶层覆盖的磷酸三钙上，构建了一种可调节骨损伤微环境中局部巨噬细胞行为的骨修复制剂。
16、如实施例所示，黄酮磷酸三钙、含硫化氢缓释载体光交联海藻酸水凝胶的磷酸钙骨水泥，表现出可调控巨噬细胞免疫微环境的功能，制剂本身即能够较好实现按m1-m2顺序诱导骨损伤微环境中的巨噬细胞先诱导m1型极化然后诱导m2型极化的功能，而现有的支架材料很难以实现上述功能。
17、另一方面，通过将磷酸钙/水凝胶支架负载硫化氢载体后，缓释出的硫化氢与磷酸三钙释放的低剂量cu(ii)相互作用，生成具有良好抗菌作用的cu(i)，并且在该体系在早期0-4周可使cu(i)、cu(ii)维持动态平衡状态。如实施例所示，发现二者的结合起到了很好的相互促进作用，能够使得抑制剂的使用剂量大大减小，不但大大降低了铜对巨噬细胞的毒副作用，其降幅达到10倍以上，并且可以显著巨噬细胞的m1向极化作用，从而达到胞内杀菌效果。
18、本专利技术中的磷酸三钙在水溶液中会自固化形成磷酸钙骨水泥(cpc)，已应用于临床骨修复并表现出良好的骨整合性能，而金属磷酸三钙预混膏剂(pcpc)不但可以表现良好的骨整合功能，还能改善自固化磷酸钙骨水泥的手工操作的缺陷。而海藻酸钠水凝胶、硫化氢载体及铜(ii)离子、黄酮化合物组合得到的pcpc水凝胶制剂不仅可以提供调控cpc的降解速率、提高其吸水性，在降解4-8本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种顺序调控巨噬细胞免疫微环境的抗感染促骨修复制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按重量百分含量计，将1-10％黄酮改性羟基磷灰石、2-10％海藻酸钠水凝胶、0.1-1％硫化氢缓释载体和79-96.9％铜磷酸三钙膏剂按比例混合均匀，加入含Na2HPO4的氯化钙水溶液，搅拌均匀，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄酮改性羟基磷灰石中，Ca离子浓度范围0.1-0.5mol/L，黄酮化合物/Ca摩尔比为0.002～0.01:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄酮改性羟基磷灰石的制备方法包括：按Ca/P摩尔比1.67将(NH4)2HPO4水溶液和黄酮化合物的水醇溶液同时逐滴滴入Ca(NO3)2·4H2O水溶液中，边滴边搅拌，室温下保持搅拌3-5天；然后升温至在70-90℃，并用稀氨水将pH调节并保持至10，持续恒温搅拌3-5小时，然后以10000rpm离心10分钟，去离子水反复洗涤；最后，冷冻干燥成粉末，研磨并过100-200目筛子，即得黄酮改性羟基磷灰石粉末。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述海藻酸钠水凝胶的制备方法包括：将含2％(w/v)甲基丙烯酸酯化海藻酸钠及0.1％(w/v)光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的水溶液用波长365nm、强度1.7mW/cm2的紫外线灯照射20min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫化氢缓释载体为GYY4137、ADT-OH或AP39；所述Na2HPO4的浓度为质量体积比2％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铜磷酸三钙膏剂的制备方法包括：将磷酸三钙加入0.2mol/L CuCl2·2H2O水溶液，搅拌均匀，其中固相与液相比例为1:(0.3～0.6)g/mL；所述磷酸三钙含质量分数5％无定型磷酸三钙、8％β-磷酸三钙和87％α-磷酸三钙。
8.权利要求1、2、3、5、6或7所述的方法制备得到的顺序调控巨噬细胞免疫微环境的抗感染促骨修复制剂。
9.根据权利要求8所述的顺序调控巨噬细胞免疫微环境的抗感染促骨修复制剂，其特征在于，所述顺序调控巨噬细胞免疫微环境为0-4周增强巨噬细胞向M1型极化，4-8周诱导其向M2型极化。
10.权利要求8所述的顺序调控巨噬细胞免疫微环境的抗感染促骨修复制剂在促进骨修复、巨噬细胞极化、静脉内皮血管细胞增殖、成骨细胞增殖或骨髓间充质干细胞成骨分化中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种顺序调控巨噬细胞免疫微环境的抗感染促骨修复制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按重量百分含量计，将1-10％黄酮改性羟基磷灰石、2-10％海藻酸钠水凝胶、0.1-1％硫化氢缓释载体和79-96.9％铜磷酸三钙膏剂按比例混合均匀，加入含na2hpo4的氯化钙水溶液，搅拌均匀，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄酮改性羟基磷灰石中，ca离子浓度范围0.1-0.5mol/l，黄酮化合物/ca摩尔比为0.002～0.01:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄酮改性羟基磷灰石的制备方法包括：按ca/p摩尔比1.67将(nh4)2hpo4水溶液和黄酮化合物的水醇溶液同时逐滴滴入ca(no3)2·4h2o水溶液中，边滴边搅拌，室温下保持搅拌3-5天；然后升温至在70-90℃，并用稀氨水将ph调节并保持至10，持续恒温搅拌3-5小时，然后以10000rpm离心10分钟，去离子水反复洗涤；最后，冷冻干燥成粉末，研磨并过100-200目筛子，即得黄酮改性羟基磷灰石粉末。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述黄酮为3-羟基黄酮、5-羟基黄酮、6-羟基黄酮、3,7-二羟基黄酮、白杨素或高良姜素。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：疏秀林，谢小保，廖俊达，王倩，李彩玲，施庆珊，
申请(专利权)人：广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：
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