【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于增加酶活性的方法，以及用于在细胞中生产被包含在信息素、特别是蛾信息素中的化合物的方法，所述化合物是诸如饱和的和去饱和的脂肪醇、饱和的和去饱和的脂肪酸以及饱和的和去饱和的脂肪醇乙酸酯、及其衍生物。
技术介绍
1、预期害虫综合治理(ipm)在提高作物产量、最大限度地减少环境影响和实现有机食品生产方面发挥重要作用。ipm采用替代性害虫控制方法，诸如使用信息素破坏交配、使用信息素进行大规模诱捕、有益昆虫等。
2、信息素构成一组不同的化学物质，昆虫(像其它生物一样)在各种情况下用它们与同一物种的个体进行交流，所述情况包括配偶吸引、警报、踪迹标记和聚集。与远距离配偶寻找相关的昆虫信息素已经在农业和林业应用中用于监测和控制害虫，作为杀虫剂的安全且环境友好的替代品。用于害虫控制的信息素的生物生产在价格、特异性和环境影响方面优于化学合成。
3、鳞翅目(lepidoptera)蛾的i型信息素是10至18个碳链长度的不饱和脂肪醇、醛或乙酸酯。在雄蛾触角中的受体对具有特定链长度、右立体异构体(双键的z或e确认)中特定碳处的去饱和以及末端官能团的信息素具有选择性(tupec,bucek,valterova，和pichova,2017)。几种生物合成酶会促进信息素生产，包括脂肪酰基辅酶a去饱和酶和脂肪酰基辅酶a还原酶。所述去饱和酶将双键引入脂肪酰基辅酶a中。它们被认为是从nadh接收细胞色素b5还原酶和细胞色素b5提供的电子的整合膜蛋白。所述脂肪酰基还原酶将饱和的或去饱和的脂肪酰基辅酶a转化为饱和的或去饱和的脂肪醇
4、除了“经典的”单结构域膜结合的细胞色素b5还原酶(cytb5red)和细胞色素b5(cytb5)之外，另一种名为nad(p)h细胞色素b5氧化还原酶(ncb5or；也被称作细胞色素b5还原酶4或cyb5r4)的flavoheme还原酶是在动物界高度保守的。ncb5or酶与经典的cytb5red/cytb5对不同，因为ncb5or含有三个结构域：细胞色素b5-样结构域、细胞色素b5还原酶-样结构域和chord-sgt1(cs结构域)(deng，等人,2010)(参见图1)。cs结构域存在于许多不同的蛋白质中，并且被认为参与蛋白质-蛋白质相互作用(benson，等人,2019；zhu，等人,2004)。与cytb5red相比，ncb5or cytb5red-样结构域含有多个插入和缺失(benson等人,2019)。cytb5-样结构域也是如此(图2)(benson等人,2019)。与cytb5red/cytb5系统相比，ncb5or被认为具有根本不同的电子转移机制(benson等人,2019)。此外，它们具有利用nadh和nadph的非凡能力(benson等人,2019)。
5、已经主要在小鼠或人细胞系中研究了可溶性的ncb5or，其中ncb5or的敲除已经导致δ9去饱和的减少(zambo，等人,2020；larade，等人,2008)。迄今为止，据我们所知，还没有在昆虫中关于ncb5or基因或其功能的描述。
技术实现思路
1、本专利技术如在权利要求书中所定义。
2、本文提供了一种细胞，其表达：
3、i)第一种酶或第一组酶，所述酶能够将脂肪酰基辅酶a转化为选自去饱和的脂肪醇、饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪醇乙酸酯和去饱和的脂肪酰基辅酶a的化合物；和
4、ii)异源nad(p)h细胞色素b5氧化还原酶(ncb5or)；
5、由此当在相同条件下培养时，与表达所述第一组酶、但不表达异源ncb5or的细胞相比，所述细胞能够以更高的滴度和/或纯度生产所述化合物。
6、本文还提供了一种细胞，其表达：
7、i)第一种酶或第一组酶，所述酶能够将脂肪酰基辅酶a转化为选自去饱和的脂肪醇、饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪醇乙酸酯、去饱和的脂肪酰基辅酶a和去饱和的脂肪酸的化合物；和
8、ii)异源nad(p)h细胞色素b5氧化还原酶(ncb5or)；
9、由此当在相同条件下培养时，与表达所述第一组酶、但不表达异源ncb5or的细胞相比，所述细胞能够以更高的滴度和/或纯度生产所述化合物。
10、本文进一步提供了一种用于增加至少一种酶的活性的方法，所述酶选自由去饱和酶和脂肪酰基辅酶a还原酶(far)组成的组，所述方法包括以下步骤：
11、a.提供去饱和酶，所述酶能够在脂肪酰基辅酶a中引入至少一个双键，从而将所述脂肪酰基辅酶a的至少一部分转化为去饱和的脂肪酰基辅酶a；和/或
12、b.提供far，所述far能够将所述去饱和的脂肪酰基辅酶a的至少一部分转化为去饱和的脂肪醇，从而生产所述去饱和的脂肪醇；和
13、c.使所述去饱和酶和/或far与ncb5or接触，从而与在没有所述ncb5or存在下所述去饱和酶和/或far的活性相比，增加所述去饱和酶和/或far的活性，其中在相同条件下测量所述活性；
14、其中通过测量由所述去饱和酶和/或所述far形成的产物的浓度来测量活性的增加。
15、本文还提供了一种用于在细胞中生产选自去饱和的脂肪醇、饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪醇乙酸酯和去饱和的脂肪酰基辅酶a的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
16、a.提供细胞并在培养基中温育所述细胞；和
17、b.在所述细胞中表达能够将脂肪酰基辅酶a转化为所述化合物的第一种酶或第一组酶，从而将所述脂肪酰基辅酶a的至少一部分转化为所述化合物；和
18、c.在所述细胞中表达ncb5or；
19、d.任选地，回收所述化合物。
20、本文进一步提供了一种用于增加在细胞中生产的选自去饱和的脂肪醇、饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪醇乙酸酯和去饱和的脂肪酰基辅酶a的化合物的滴度和/或纯度的方法，所述细胞能够合成一种或多种脂肪酰基辅酶a和/或能够从其环境中输入脂肪酰基辅酶a，所述方法包括以下步骤：
21、a.在所述细胞中表达能够将脂肪酰基辅酶a转化为所述化合物的第一种酶或第一组酶，从而将所述脂肪酰基辅酶a的至少一部分转化为所述化合物；和
22、b.在所述细胞中表达ncb5or，从而与在相同条件下来自不表达所述ncb5or的细胞的滴度和/或纯度相比，增加所述化合物的滴度和/或纯度；
23、c.任选地，回收所述化合物。
24、本文还提供了核酸构建体系统，其包含编码ncb5or和以下的核酸：
25、a.能够在脂肪酰基辅酶a中引入至少一个双键的去饱和酶；和/或
26、b.脂肪酰基辅酶a还原酶far，其能够将去饱和的脂肪酰基辅酶a的至少一部分转化为去饱和的脂肪醇。
27、本文进一步提供了一种部件试剂盒，其包含：
28、a.在本申请中提供的细胞；
29、b.在本申请中提供的核酸系统，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞，其表达：
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述第一种酶或第一组酶包含以下或由以下组成：
3.根据前述权利要求中的任一项所述的细胞，其中所述Ncb5or对于植物、昆虫或哺乳动物例如智人(Homo sapiens)而言是天然的，优选地其中所述Ncb5or对于昆虫而言是天然的，所述昆虫诸如夜蛾属(Agrotis)、Amyelois、Aphantopus、灯蛾属(Arctia)、蔽眼蝶属(Bicyclus)、熊蜂属(Bombus)、家蚕属(Bombyx)、禾草螟属(Chilo)、小卷蛾属(Cydia)、斑蝶属(Danaus)、果蝇属(Drosophila)、大蓑蛾属(Eumeta)、大蜡螟属(Galleria)、棉铃虫属(Helicoverpa)、实夜蛾属(Heliothis)、海波斯莫科马属(Hyposmocoma)、小粉蝶属(Leptidea)、花翅小卷蛾属(Lobesia)、Manduca、秋尺蛾属(Operophtera)、秆野螟属(Ostrinia)、凤蝶亚属(Papilio)、凤蝶亚属(Papilio)、凤蝶亚属(Papilio)、菜粉
4.根据前述权利要求中的任一项所述的细胞，其中所述Ncb5or选自以下的组：在SEQID NO:111至114、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:182至185中所示的Ncb5or，或与其具有至少70％同一性的变体，例如与其具有至少75％同一性，诸如至少80％同一性，诸如至少85％同一性，诸如至少90％同一性，诸如至少95％同一性。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的细胞，其中所述去饱和酶对植物而言是天然的，诸如蓖麻(Ricinus communis)或天竺葵(Pelargonium hortorum)，或对昆虫而言是天然的，诸如双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)或鳞翅目(Lepidoptera)的昆虫，诸如夜蛾属(Agrotis)、柞蚕属(Antheraea)、带卷蛾属(Argyrotaenia)、Amyelois、熊蜂属(Bombus)、家蚕属(Bombyx)、果斑螟属(Cadra)、花萤属(Chauliognathus)、禾草螟属(Chilo)、色卷蛾属(Choristoneura)、小卷蛾属(Cydia)、松毛虫属(Dendrophilus)、杆草螟属(Diatraea)、果蝇属(Drosophila)、粉斑螟属(Ephestia)、Epiphyas、小食心虫属(Grapholita)、棉铃虫属(Helicoverpa)、Lampronia、花翅小卷蛾属(Lobesia)、Manducta、秆野...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种细胞，其表达：
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述第一种酶或第一组酶包含以下或由以下组成：
3.根据前述权利要求中的任一项所述的细胞，其中所述ncb5or对于植物、昆虫或哺乳动物例如智人(homo sapiens)而言是天然的，优选地其中所述ncb5or对于昆虫而言是天然的，所述昆虫诸如夜蛾属(agrotis)、amyelois、aphantopus、灯蛾属(arctia)、蔽眼蝶属(bicyclus)、熊蜂属(bombus)、家蚕属(bombyx)、禾草螟属(chilo)、小卷蛾属(cydia)、斑蝶属(danaus)、果蝇属(drosophila)、大蓑蛾属(eumeta)、大蜡螟属(galleria)、棉铃虫属(helicoverpa)、实夜蛾属(heliothis)、海波斯莫科马属(hyposmocoma)、小粉蝶属(leptidea)、花翅小卷蛾属(lobesia)、manduca、秋尺蛾属(operophtera)、秆野螟属(ostrinia)、凤蝶亚属(papilio)、凤蝶亚属(papilio)、凤蝶亚属(papilio)、菜粉蝶属(pieris)、菜蛾属(plutella)、灰翅夜蛾属(spodoptera)、粉夜蛾属(trichoplusia)和红蛱蝶属(vanessa)的昆虫，诸如其中所述ncb5or对于选自黄地老虎(agrotis segetum)、脐橙螟蛾(amyelois transitella)、阿芬眼蝶(aphantopus hyperantus)、木虎蛾(arctiaplantaginis)、偏瞳蔽眼蝶(bicyclus anynana)、欧洲熊蜂(bombus terrestris)、野桑蚕(bombyx mandarina)、家蚕(bombyx mori)、二化螟(chilo suppressalis)、苹果蠹蛾(cydia pomonella)、黑脉金斑蝶(danaus plexippus)、drosophila grimshawi、黑腹果蝇(drosophila melanogaster)、大避债蛾(eumeta japonica)、大蜡螟(galleriamellonella)、棉铃虫(helicoverpa armigera)、烟芽夜蛾(heliothis virescens)、hyposmocoma kahamanoa、条纹小粉蝶(leptidea sinapis)、葡萄花翅小卷蛾(lobesiabotrana)、烟草天蛾(manduca sexta)、冬尺蠖蛾(operophtera brumata)、亚洲玉米螟(ostrinia furnacalis)、金凤蝶(papilio machaon)、玉带凤蝶(papilio polytes)、柑橘凤蝶(papilio xuthus)、菜粉蝶(pieris rapae)、小菜蛾(plutella xylostella)、草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)、斜纹夜蛾(spodoptera litura)、粉纹夜蛾(richoplusiani)和夏威夷红蛱蝶(vanessa tameamea)的昆虫而言是天然的。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的细胞，其中所述ncb5or选自以下的组：在seqid no:111至114、seq id no:124和seq id no:182至185中所示的ncb5or，或与其具有至少70％同一性的变体，例如与其具有至少75％同一性，诸如至少80％同一性，诸如至少85％同一性，诸如至少90％同一性，诸如至少95％同一性。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的细胞，其中所述去饱和酶对植物而言是天然的，诸如蓖麻(ricinus communis)或天竺葵(pelargonium hortorum)，或对昆虫而言是天然的，诸如双翅目(diptera)、鞘翅目(coleoptera)或鳞翅目(lepidoptera)的昆虫，诸如夜蛾属(agrotis)、柞蚕属(antheraea)、带卷蛾属(argyrotaenia)、amyelois、熊蜂属(bombus)、家蚕属(bombyx)、果斑螟属(cadra)、花萤属(chauliognathus)、禾草螟属(chilo)、色卷蛾属(choristoneura)、小卷蛾属(cydia)、松毛虫属(dendrophilus)、杆草螟属(diatraea)、果蝇属(drosophila)、粉斑螟属(ephestia)、epiphyas、小食心虫属(grapholita)、棉铃虫属(helicoverpa)、lampronia、花翅小卷蛾属(lobesia)、manducta、秆野螟属(ostrinia)、红铃虫属(pectinophora)、谷斑螟属(plodia)、菜蛾属(plutella)、海链藻属(thalassiosira)、异舟蛾属(thaumetopoea)、拟谷盗属(tribolium)、粉夜蛾属(trichoplusia)、灰翅夜蛾属(spodoptera)或巢蛾属(yponomeuta)的昆虫，诸如黄地老虎(agrotis segetum)、柞蚕(antheraea pernyi)、红带卷蛾(argyrotaenia velutiana)、脐橙螟蛾(amyelois transitella)、红尾熊蜂(bombus lapidarius)、家蚕(bombyx mori)、粉斑螟蛾(cadra cautella)、瘟疫丽艳花萤(chauliognathus lugubris)、二化螟(chilosupprealis)、平行带状卷叶蛾(choristoneura parallela)、蔷薇斜条卷叶蛾(choristoneura rosaceana)、苹果蠹蛾(cydia pomonella)、马尾松毛虫(dendrophiluspunctatus)、小蔗杆草螟(diatraea saccharalis)、嗜凤梨果蝇(drosophila ananassae)、黑腹果蝇(drosophila melanogaster)、大果蝇(drosophila virilis)、drosophilayakuba、烟草粉螟(ephestia elutella)、地中海粉斑螟(ephestia kuehniella)、苹淡褐卷蛾(epip...
【专利技术属性】
技术研发人员：I·波罗迪娜，C·霍尔肯布林克，K·R·基尔戴高德，K·佩特凯维舍斯，L·温宁，
申请(专利权)人：富美实农业解决方案公司，
类型：发明
国别省市：
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