【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生化检测，特别是涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂盒和应用。
技术介绍
1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican3,gpc3)是硫酸乙酰肝素糖蛋白家族中的一员，它通过c端与糖基磷脂酰基醇的结合而锚定于细胞外膜上。1996年耶鲁大学在研究一种x染色体连锁的隐性遗传病simpson-golabi-behmel过度增长综合征(sgbs)时第一次发现了gpc3基因(又称mxr-7或者oci-5基因)，该基因定位于人染色体xq26，基因结构全长大于900kb，是人类基因组中最大的基因之一，由8个外显子，7个内含子组成。其相对分子质量为60000，在358位的精氨酸与359位的丝氨酸发生解离，n端进入血液中，称为可溶性gpc3，相对分子质量为40000，研究发现gpc3在生长因子的信号传导中其扮演重要角色，从而在细胞增殖、分化及迁移中发挥重要作用，起到调节肿瘤细胞增殖的活性的作用。近年来大量研究发现gpc3在胚胎肝脏组织、肝癌组织及大部分肝癌细胞系中高水平表达，而在正常肝组织几乎无表达，提示gpc3可以作为一种有价值的肝癌组织学肿瘤标记物。
2、原发性肝癌是常见的消化道恶性肿瘤，其中肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是主要的病理类型，占原发性肝癌的85％～90％。我国hcc新发病例和死亡病例约占全球的50％，严重威胁人民生命与健康。hcc起病隐匿，确诊时多属中晚期，失去手术根治机会，5年生存率不足15％。因此，早期诊断对改善hcc临床结局具有重要意义。目前，甲胎蛋白(α-fet
3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，gpc3)是gpc家族中的一员，是一类锚定在细胞膜上的癌胚蛋白。越来越多证据表明hcc患者血清中gpc3蛋白与外周血gpc3 mrna高表达。此外，有研究显示gpc3可鉴别afp阴性的hcc与肝脏良性结节。因此认为，gpc3是极具潜力的hcc诊断标志物。
4、目前临床检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的方法主要有化学发光法、酶联免疫吸附实验法(elisa)等，化学发光法准确性和灵敏度高，但是仪器设备昂贵，成本较高；酶联免疫吸附实验法(elisa)目前在临床应用广泛，技术成熟，虽然在灵敏度、特异性、试剂价格等方面占有优势，但该技术在检测时间、操作性等方面存在弊端。胶乳免疫比浊法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析、成本较低的优点，但现在国内该方法试剂盒非常少，而且存在反应不灵敏、线性范围窄、稳定性较差、应用困难等问题，本专利技术针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3进行胶乳增强免疫比浊法的研发以满足医院大规模临床检测以及化学分析的要求。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供一种胶乳免疫比浊法的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂盒，该试剂盒是稳定性强、准确度高、线性范围广、灵敏度高、抗干扰的液体试剂盒。
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂盒由以下成分组成，该试剂盒含有试剂r1和试剂r2；
4、试剂r1包含以下组分：
5、
6、试剂r2包含以下组分：
7、
8、优选地，所述试剂r1的ph为6.0-8.0；所述试剂r2的ph为6.0-8.0。
9、优选地，所述试剂r1中的表面活性剂为花王emulgen102、emulgen103、emulgen107、emulgen109的一种或多种。
10、优选地，所述试剂r1阻断剂为羊igg、小鼠igg、兔igg的一种或多种。
11、优选地，所述试剂r2中的稳定剂为左旋糖酸钙和葡聚糖，且质量比为1:1。
12、优选地，所述试剂r1中的分散剂为木质素磺酸钠。
13、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体包被胶乳微球的制备方法为：取适量聚苯乙烯胶乳微球加入50mmol/l ph6.0的mes缓冲液中，使其胶乳微球终浓度为1％，加入10mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐edac溶液，室温反应1小时，12000rpm离心20min，用50mmol/l ph6.0的mes缓冲液洗涤两次；然后加入磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，在37℃孵育2小时，与胶乳微球进行偶联，形成抗体胶乳复合物；然后，加入适量的1％的酪蛋白和0.5％的n,n-二甲基甲酰胺在37℃条件下封闭1小时，再以12000rpm离心30分钟，去除上清，所得沉淀加入50mmol/l的hepes缓冲液洗涤、分散即磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体包被胶乳微球。
14、优选地，所述试剂r2中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为羊抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3多克隆抗体和鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体，且质量比3:2。
15、优选地，所述试剂r2中的聚苯乙烯胶乳微球粒径分别为418nm、122nm，两种胶乳微球的体积比例为1:4。
16、将上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的浓度。
17、本专利技术有益效果：
18、1、本专利技术试剂r1中的表面活性剂为花王emulgen系列，能有效的去除血脂、乳糜干扰，使试剂r1体系均一分散，大大增强试剂的抗干扰能力。
19、2、本专利技术试剂r1加入阻断剂，能消除或者降低免疫分析中类风湿因子和异嗜性抗体造成的内源性干扰，提高反应的准确性和特异性。
20、3、本专利技术试剂r2中添加稳定剂左旋糖酸钙、葡聚糖和分散剂木质素磺酸钠，提高了试剂中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体包被胶乳微球的稳定性，使试剂r2稳定性能优异。
21、4、本专利技术抗体为单克隆抗体与多克隆抗体的混合，提高反应的特异性和灵敏度。
22、5、本专利技术制备的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂稳定性好、准确度高、灵敏度高、线性范围广，明显优于市售的同类型产品。
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1.一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂盒由以下成分组成，其特征在于，该试剂盒含有试剂R1和试剂R2；
2.一种权利要求1所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂盒的制备方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体包被胶乳微球的制备方法为：取适量聚苯乙烯胶乳微球加入50mmol/L pH6.0的MES缓冲液中，使其胶乳微球终浓度为1％，加入10mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDAC溶液，室温反应1小时，12000rpm离心20min，用50mmol/L pH6.0的MES缓冲液洗涤两次；然后加入磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，在37℃孵育2小时，与胶乳微球进行偶联，形成抗体胶乳复合物；然后，加入适量的1％的酪蛋白和0.5％的N,N-二甲基甲酰胺在37℃条件下封闭1小时，再以12000rpm离心30分钟，去除上清，所得沉淀加入50mmol/L的HEPES缓冲液洗涤、分散即磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体包被胶乳微球。
4.根据权利要求3所述的制备方法，
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述试剂R2中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为羊抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3多克隆抗体和鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体，且质量比3:2。
6.一种权利要求1所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的浓度。
...【技术特征摘要】
1.一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂盒由以下成分组成，其特征在于，该试剂盒含有试剂r1和试剂r2；
2.一种权利要求1所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3测定试剂盒的制备方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体包被胶乳微球的制备方法为：取适量聚苯乙烯胶乳微球加入50mmol/l ph6.0的mes缓冲液中，使其胶乳微球终浓度为1％，加入10mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐edac溶液，室温反应1小时，12000rpm离心20min，用50mmol/l ph6.0的mes缓冲液洗涤两次；然后加入磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，在37℃孵育2小时，与胶乳微球进行偶联，形成抗体胶乳复合物...
【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，隗勇，胡书祥，徐玉超，
申请(专利权)人：中拓生物有限公司，
类型：发明
国别省市：
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