【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及免疫学，具体涉及一种cd64流式抗体标记荧光蛋白的制备方法。
技术介绍
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技术介绍
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1、cd64又称作fc-gamma受体蛋白1(fcyri)，是一个70kda穿膜糖蛋白，在外周血中性粒细胞表面呈现低表达，当机体受到感染或内毒素入侵时，大量致炎细胞因子引起中性粒细胞表面的cd64由低表达迅速转变为高表达，并活化中性粒细胞。一般情况，机体感染或内毒素入侵时cd64在刺激后4～6h即可升高。cd64的表达无性别差异。不同病原体引起的活化程度具有差异，研究发现其能够区分自身免疫性疾病活动期或合并感染，并可监测抗菌药物疗效和术后是否并发感染,有良好的临床应用前景。因此被作为一项高敏感、高特异的诊断感染性疾病的早期标志物。
2、目前流式细胞术检测粒细胞cd64的指数作为感染性疾病提供诊断依据，但其荧光强度受到仪器、试剂等因素影响。特别是试剂如抗体标记荧光蛋白活性直接影响检测结果。目前抗体标记荧光蛋白有多种方法，当前流式抗体标记常采用spdp或其类似物，或者smcc或其类似物作为异型双功能键交联剂，通过nhs酯与抗体上伯胺反应、并利用dtt、bme将二硫键还原为巯基后与马来酰亚胺交联，将荧光蛋白标记到单克隆抗体上，由于反应不充分问题等不可避免地会产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使偶联效率降低、结合物活性减弱。
3、专利cn102680674a提供了一种藻红蛋白标记抗体的方法，采用spdp首先通过其氨基与蛋白质分子反应。将吡啶基二硫化物部分引入蛋白质，抗体经2-亚氨基硫烷处理将胺一
4、因此，开发一种特异性强、操作简单、更灵敏的标记方法有重要的应用价值和社会效益。
技术实现思路
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技术实现思路
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1、本专利技术在深入研究的基础上，提供了一种荧光蛋白标记抗体方法包括以下步骤：
2、1、将待标记抗体与4-叠氮苯甲酰氟(abf)或叠氮基丁酸nhs酯试剂混合，通过基团与抗体上赖氨酸氨基发生伯胺反应生成叠氮化抗体位点特异性酰化，快速形成酰化产物，将其末端叠氮基；
3、2、用dbco-stp或dbco-nhs与荧光蛋白如藻蓝蛋白、藻红蛋白在中性或弱碱条件下发生伯胺反应形成共价键，将炔烃官能团引入到荧光蛋白；
4、3、将带有叠氮基的抗体与带有炔烃基的荧光蛋白混合，在温和条件下叠氮基与炔烃定向结合发生反应，形成稳定的三唑键，实现抗体标记荧光蛋白。
5、与现有技术相比，本专利技术的积极和有益效果在于：
6、(1)本专利技术采用抗体与含叠氮基的偶联试剂，将叠氮基部分特异性连接到igg抗体的长链上，从而确保抗原结合结构域保持不变，可以结合到抗原靶标上，容易获得纯的叠氮化抗体试剂且抗体活性无影响；
7、(2)本专利技术将荧光蛋白将交联试剂中的dbco官能团引入荧光蛋白中，在温和条件下，叠氮基与炔烃官能团向结合，将荧光蛋白连接至抗体上，提高了荧光蛋白与抗体偶联的特异性与偶联效率；
8、(3)本专利技术是一种以点击化学方法将标记dbco的荧光蛋白或荧光染料定向偶联到叠氮基
9、修饰的抗体抗体上，根据实验需要可灵活地为抗体选择不同标记荧光蛋白或荧光染料；(4)本专利技术实验步骤操作简单，条件温和、偶联效率高、位点特异性、可重现标记化学产生
10、高质量抗体偶联物，简便了偶联操作步骤，提高了荧光信号强度，为抗体标记荧光蛋白提供了一种新选择。
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1.一种CD64单克隆抗体标记荧光蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的交联剂A为叠氮基丁酸NHS酯或4-叠氮苯甲酰氟。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，抗体CD64与交联剂A的摩尔比为1:3-100。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，单克隆抗体与所述的交联剂A的反应条件为恒温摇床150rpm/min、30℃避光反应30-60min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的荧光蛋白与所述的交联剂B的摩尔比为1:10-50。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的荧光蛋白与所述的交联剂B的反应条件为恒温摇床150rpm/min、30℃反应30-60min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的交联剂B为DBCO-STP或DBCO-NHS。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的叠氮基修饰的单克隆抗体与炔烃基修饰
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的反应条件为恒温摇床150rpm/min、30℃反应20-30min。
...【技术特征摘要】
1.一种cd64单克隆抗体标记荧光蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的交联剂a为叠氮基丁酸nhs酯或4-叠氮苯甲酰氟。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，抗体cd64与交联剂a的摩尔比为1:3-100。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，单克隆抗体与所述的交联剂a的反应条件为恒温摇床150rpm/min、30℃避光反应30-60min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的荧光蛋白与所述的交联剂b的摩尔比为1:10-5...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐玉超，隗勇，胡书祥，王飞，
申请(专利权)人：中拓生物有限公司，
类型：发明
国别省市：
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