一种白藜芦醇的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种白藜芦醇的制备方法。首先采用紫外线照射原生质体的方法诱变酿酒酵母，选择葡萄糖苷酶活５００ｕ以上的诱变菌株，以１０％脱脂乳粉液作为发酵培养基，培养酵母活菌数≥１０９个／ｍｌ后，制备酿酒酵母冻干菌种。将葡萄酒渣加入其重量５倍的去离子水，通过胶体磨超微粉碎，１００目过筛后制成葡萄酒渣浆料，每吨浆料添加２０公斤蔗糖，经过１２１℃高温灭菌２０分钟，然后冷却至２８℃，接种酿酒酵母冻干菌种，保温发酵５５－６０小时，离心除渣后，取上清液用４０－４５％（Ｖ／Ｖ）的乙醇进行醇沉，取沉淀用９０－９５％（Ｖ／Ｖ）的乙醇洗涤精致、烘干后获得白藜芦醇。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用酿酒酵母发酵葡萄酒渣制备白藜芦醇的方法，属生物工程领 域。
技术介绍
每年世界葡萄总产量中80%用于酿酒，由葡萄的世界产量可知，葡萄酒的世界年 产量也是个庞大的数字。中国的葡萄酒产业发展历史较短，但随着中国经济的腾飞，其葡萄 酒生产的发展速度也是相当惊人。据统计，从1996年至2004年，中国葡萄酒的产量从17 刀吨增长到40万吨，年平均增长率为11. 3%。据报道，2010年我国葡萄酒年产量有望达 到80万吨。由于葡萄酒的大量生产和消费，同时也产生了大量的葡萄酿酒后的副产品—— 葡萄酒渣(葡萄皮渣、籽、梗)。一些发达国家如法国、意大利、西班牙等这些葡萄酒生产大 国，其葡萄废弃物的70%以上均能得到很好的利用，但我国常年来由于葡萄酒生产季节性 强、生产集中，导致这些废弃物往往来不及处理就被随意抛弃或作为废料处理掉，这不仅影 响环境卫生，而且也是对资源的极度浪费。研究表明，酿酒后的葡萄废弃物中含有大量以植 物多酚为主的生物活性物质，如白藜芦醇、酚酸、黄酮、原花青素等，这些物质具有非常重要 的生理功能特性，因此有极大的开发前景。本专利技术采用酿酒酵母发酵葡萄酒渣，经过酒精提取、精致后制备白藜芦醇，本产品 可以广泛应用于保健食品中。白藜芦醇具有抗癌、保护心血管、抗氧化、抗自由基、抗血小板 聚集、雌激素样、抗炎等生理作用，因此，开发和利用白藜芦醇不仅为葡萄皮渣的综合利用 开辟了新途径，还可带来巨大的经济效益和社会效益，具有广阔的开发前景。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供。本专利技术的目的是这样实现的本专利技术中所涉及的百分比除另有注明之外为质量 比，本专利技术的产品采用这样的方法来制备的1.酿酒酵母的选择及培养基的制备本专利技术选择的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)购置于中国工业微生物菌 种包藏中心，编号为31482，培养基为5° Β 麦芽汁。2.发酵菌株的诱变及驯化过程菌种的诱变采用紫外线照射原生质体的方法。取经0. 6u/mL青霉素预处理1. 5h 的菌液5mL于离心管中，4000r/min离心，弃上清液，用高渗液洗涤菌体2次，配成高渗菌悬 液，加入1. Orag/mL溶菌酶于34°C保温15h，离心洗涤，用高渗液悬浮，制成原生质体高渗悬 浮液。采用15W紫外灯，距离30cm，照射O 30s，边搅拌边照射，力求使菌体均勻吸收紫 外线光波，以上照射过程在暗室中进行，以免光修复。将经过紫外线诱变后的菌体转入到无 菌试管中，并立即浸入冰水中lh，在低温条件下，细胞内参与对突变体修复的各种酶类活性受到抑制，使修复难以进行，有利于提高突变率。采用夹层法于32°C恒温箱中培养48h，从培养至对数生长期的平板上随机挑取若 干个单菌落接种到试管琼脂斜面中，在28°C培养5d后，挑取菌体生长相对较好的试管中的 菌体用摇瓶进行复筛。复筛将菌体生长相对较好的试管中的菌体分别接种到盛有200mL发酵培养基的 500mL三角瓶中，在28°C，150转/分钟条件下培养3d，检测葡萄糖苷酶活，选择酶活500u 以上的菌种均可作为发酵葡萄酒渣出发菌株。葡萄糖苷酶活检测方法β 一葡萄糖苷酶活力国际单位定义为以P-NPG (对-硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷) 为底物，在一定的分析条件下，每min释放Inmol对一硝基苯酚所需要的酶量为一个活力单 位。在一定条件，β -葡萄糖苷酶能够水解对-硝基苯酚-β -D-葡萄糖苷中的糖苷 键，生成对-硝基苯酚，在碱性条件下显黄色，可以通过比色法定量测定该黄色物质的含 量，进而计算出葡萄糖苷酶的活力。准确称量对-硝基苯酚139. Omg，用蒸馏水定容至 1000ml。分别吸取该溶液l，2，3，4，5，6mL至IOOmL容量瓶中，用lmol/L Na2CO3溶液定容后 混勻，使每mL稀释液分别含有对-硝基苯酚0. 01，0. 02，0. 03，0. 04，0. 05，0. 06 μ mol。以蒸 馏水为空白，在400nm吸收波长下测定其吸光值，以对一硝基苯酚浓度为横坐标，吸光度为 纵坐标，绘制标准曲线。在三个IOmL具塞试管中顺次加入0. 6mLpH7. 2柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液，0. 2mL 粗酶提取液，0. 2mL10mMp-NPG，迅速盖上试管塞立即放到37°C的水浴锅中反应30min，然后 立即加入2. OmL IMNa2CO3溶液终止反应，在对-硝基苯酚的最佳吸收波长处检测吸光值。 空白对照0. 2mL的IOmMp-NPG用0. 2mLpH7. 2柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液代替粗酶液。酶活计算酶活=YXV2XV/KXV1XMXT其中Y为酶促反应的吸光度；V为酶液的提取总量(mL) 为反应体系中酶液量 (mL) ；V为总反应液量(mL) ;V2为总反应液量(mL) ；K为对一硝基苯酚标准曲线的斜率；M为 试样重(g) ；T为反应时间(min)。3.直投式粉末冻干菌种的制备3.1母发酵剂的制备量取酿酒酵母培养基200ml于1只500ml三角瓶内，121 °C灭菌20分钟冷却至 30°C，用接种环接种诱变后的出发酵母菌株斜面一环，在30°C、150转/分钟摇床培养培养 36小时，作为母发酵剂。3. 2生产发酵剂的制备首先配置10%的脱脂奶乳浊液，121 °C灭菌20分钟冷却至28°C，分别按2%体积比 例接种母发酵剂，28°C、150转/分钟摇床培养培养，检测发酵液酵母活菌数≥ IO9个/ml， 视同为发酵成熟，如果活菌数< IO9个/ml，继续培养，直至达到IO9个/ml，结束培养，冻干 待用。3. 3粉末冻干菌种的制备将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于lcm，加盖瓶塞 后放入-30°C冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制得直 投式粉末冻干菌种。4.白藜芦醇的制备4. 1葡萄酒渣的预处理将葡萄酒渣(水分含量< 5% )加入其重量5倍的去离子水，通过胶体磨超微粉 碎，100目过筛后制成葡萄酒渣浆料，每吨浆料添加20公斤蔗糖，经过121°C高温灭菌20分 钟，然后冷却至28°C，准备接种酿酒酵母。4. 2葡萄酒渣发酵将经过4. 1步骤预处理的葡萄酒渣浆料添加3. 3步骤制备的粉末冻干菌种，添加 量为每吨葡萄酒渣浆料添加粉末冻干菌种125-130克，然后搅拌均勻，28°C、搅拌速度120 转/分钟，保温发酵55-60小时，110°C灭酶10分钟，结束发酵。4. 3白藜芦醇的提取4. 3. 1渣浆分离用10000转/分钟的管式离心机分离浆渣，保存浆料备用。4. 3. 2乙醇提取用百分比浓度为40-45% (V/V)的乙醇作为提取溶剂，乙醇与经过4. 3. 1步骤处 理的浆料体积比为10 1，提取温度40-42°C，提取时间40分钟，提取过程中每5分钟搅拌 30秒，搅拌速度120转/分钟。4. 3. 3白藜芦醇收集用15000转/分钟的管式离心机，分离经过4. 3. 2步骤处理的浆料，获得的固体即 为白藜芦醇粗品。4. 3. 4白藜芦醇精致用90-95% (V/V)的乙醇浸泡洗涤经过4. 3. 3步骤处理的白藜芦醇粗品，90-95% (V/V)的乙醇用量为待处理的白藜芦醇粗品重量的3-4倍，浸泡洗涤时间为50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白藜芦醇的制备方法，其特征是：制备酿酒酵母生产发酵剂，生产发酵剂活菌数≥１０↑［９］个／ｍｌ，然后进行冻干处理获得酿酒酵母冻干菌种，将葡萄酒渣加入其重量５倍的去离子水，通过胶体磨超微粉碎，１００目过筛后制成葡萄酒渣浆料，每吨浆料添加２０公斤蔗糖，经过１２１℃高温灭菌２０分钟，然后冷却至２８℃，每吨葡萄酒渣浆料接种酿酒酵母冻干菌种１２５－１３０克，保温发酵５５－６０小时，离心除渣后，取上清液用４０－４５％（Ｖ／Ｖ）的乙醇进行醇沉，取沉淀用９０－９５％（Ｖ／Ｖ）的乙醇洗涤精致、烘干后获得白藜芦醇。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈杰，郭兴罡，滕春红，陈成，
申请(专利权)人：哈尔滨市海澳斯生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]