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【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学,特别是涉及一种制备n1-甲基假尿苷三磷酸的方法。
技术介绍
1、在当前的疫苗研发与生产领域中,mrna疫苗得到了快速发展。与传统的灭活疫苗和减毒疫苗相比,mrna疫苗具备生产周期短,安全性更高等优势。更重要的是,在研发上,mrna 疫苗能够快速地更新迭代,因此在应对不断出现的如新冠病毒突变株等病毒上更胜一筹。
2、然而,mrna疫苗的研发也面临一些难点,其中最大的挑战之一就是mrna的免疫原性。mrna作为外源物质,进入人体后会激活人体的免疫系统,进而引发由mrna本身引起的炎症反应,并可能导致mrna还未发挥作用就被免疫系统清除。引入天然修饰核苷酸是降低mrna疫苗免疫原性的有效手段之一。
3、假尿苷(pseudouridine)是rna上最丰富的修饰核苷,又被称为rna的“第五种核苷”。2005年,katalin karikó等人发现将假尿苷引入rna中能降低其免疫原性,并且rna的免疫原性随着假尿苷引入比例的增高而降低。2008年,katalin karikó等人还发现用假尿苷完全替代尿苷的mrna不仅能极大地降低mrna的免疫原性,还能提高mrna的稳定性并增强其翻译能力。2015年,oliwia andries等人发现用n1-甲基假尿苷完全替代尿苷比用假尿苷完全替代尿苷更能降低mrna的免疫原性,且更能增强mrna的蛋白表达能力。
4、这些研究提示,将假尿苷或n1-甲基假尿苷引入mrna或许能有效降低mrna疫苗的免疫原性,增强mrna的稳定性,且增强其蛋白表
5、已上市的两款新冠mrna疫苗:mrna-1273(moderna)和bnt162b2(辉瑞-biontech)均采用n1-甲基假尿苷三磷酸(n1-met-φtp)取代尿苷三磷酸(utp)。而德国疫苗巨头curevac的新冠mrna疫苗cvncov效力很低,只有48%,这一结果引起了人们的广泛热议,人们推测这或许是由于cvncov没有使用修饰核苷所导致的。由此可见,利用假尿苷或n1-甲基假尿苷替代的方式可能将成为mrna疫苗生产的趋势。
6、n1-甲基假尿苷三磷酸(n1-met-φtp)难以获得、价格昂贵,如100 mm 的n1-甲基假尿苷三磷酸钠盐,售价约为20μl/935元。目前,n1-甲基假尿苷三磷酸一般采用化学合成法。化学合成法是一个多步骤过程,为了实现区域和立体选择性,需要进行保护与脱保护基团的过程,操作步骤复杂,成本高昂,容易产生有毒有害物质,对环境造成污染。酶法合成由于其高度的区域选择性、立体选择性、温和的反应条件、绿色环保无污染等因素越来越受到人们的重视,但是,目前尚未见n1-甲基假尿苷三磷酸的酶法合成方法,同时还能表现出高底物转化率,以发展n1-甲基假尿苷三磷酸在制备和生产上的应用。
7、因此,本领域需要开发一种制备n1-甲基假尿苷三磷酸的方法,简单易操作,符合绿色化学的生产原则,保护生态环境的同时,能够保证较好的底物转化率,以利于n1-甲基假尿苷三磷酸的大规模生产应用。
技术实现思路
1、为解决以上技术问题,本专利技术提供了一种制备n1-甲基假尿苷三磷酸的方法,以n1-甲基假尿苷为底物,添加酶催化剂和磷酸供体,构建磷酸循环,采用一锅法进行酶催化反应,得到终产物n1-甲基假尿苷三磷酸,所述酶催化反应包括如下阶段:
2、第一阶段:在液态反应体系中,以n1-甲基假尿苷为底物,以三磷酸腺苷和乙酰磷酸为磷酸供体,以焦磷酸硫胺素为辅酶,以镁盐为激酶稳定剂,在尿苷激酶的催化下进行酶催化反应,生成n1-甲基假尿苷酸;
3、第二阶段:以第一阶段中生成的n1-甲基假尿苷酸为底物,以三磷酸腺苷和乙酰磷酸为磷酸供体,以焦磷酸硫胺素为辅酶,以镁盐为激酶稳定剂,在尿苷酸激酶的催化下进行酶催化反应,生成n1-甲基假尿苷二磷酸;
4、第三阶段:以第二阶段中生成的n1-甲基假尿苷二磷酸为底物,以三磷酸腺苷和乙酰磷酸为磷酸供体,以焦磷酸硫胺素为辅酶,以镁盐为激酶稳定剂,在乙酸激酶的催化下进行酶催化反应,生成n1-甲基假尿苷三磷酸;
5、其中,所述尿苷激酶的genbank序号为egm3941553.1,所述尿苷酸激酶的genbank序号为wp_000224577.1,所述乙酸激酶的genbank序号为ake29949.1。
6、在一具体实施方式中,所述n1-甲基假尿苷的浓度为10-50 mmol/l。
7、优选地,所述n1-甲基假尿苷的浓度38.7 mmol/l。
8、在一具体实施方式中,所述三磷酸腺苷的浓度为1~10 mmol/l。
9、优选地,所述三磷酸腺苷的浓度为2~7 mmol/l;更优选地,所述三磷酸腺苷的浓度为4 mmol/l。
10、在一具体实施方式中,所述乙酰磷酸的浓度为1~200 mmol /l。
11、优选地,所述乙酰磷酸的浓度为10~190mmol /l;更优选地,所述乙酰磷酸的浓度为20~180 mmol /l;最优选地,所述乙酰磷酸的浓度为160mmol /l。
12、在一具体实施方式中,所述焦磷酸硫胺素的浓度为n1-甲基假尿苷浓度的0.1%~2%。
13、优选地,所述焦磷酸硫胺素的浓度为n1-甲基假尿苷浓度的1%。
14、在一具体实施方式中,所述镁盐的浓度为1 mmol/l~20 mmol/l,所述镁盐为氯化镁、硫酸镁和硝酸镁中的任意一种或多种的组合。
15、优选地,所述镁盐的浓度为10mmol/l,所述镁盐为氯化镁。
16、在一具体实施方式中,所述液态反应体系的缓冲液为浓度为50 mmol/l的磷酸盐缓冲液。
17、在一具体实施方式中,所述酶催化反应的温度为30℃~40℃,所述酶催化反应的反应时间为2~28h,所述酶催化反应的ph为6.0~9.0。
18、优选地,所述酶催化反应的温度为30℃,所述酶催化反应的反应时间为4h,所述酶催化反应的ph为7.0~8.0;更优选地,所述酶催化反应的ph为7.0。
19、在一具体实施方式中,所述液态反应体系中,所述尿苷激酶、尿苷酸激酶和乙酸激酶的存在形式为:游离形式的酶、固定化酶或菌体形式的酶。
20、本专利技术的另一方面还提供了一种反应体系,所述反应体系包括水性溶剂、底物n1-甲基假尿苷、酶催化剂、三磷酸腺苷、乙酰磷酸、辅酶和激酶稳定剂;
21、其中,所述酶催化剂包括尿苷激酶、尿苷酸激酶和乙酸激酶,所述尿苷激酶的genbank序号为egm3941553.1,所述尿苷酸激酶的genbank序号为wp_000224577.1,所述乙酸激酶的genbank序号为ake29949.1。
22、在一具体实施方式中,所述辅酶为焦磷酸硫胺素,所述激酶稳定剂为氯化镁、硫酸镁和硝酸镁中的任意一种或多种的组合。
23、在一具体实施方式中,所述水性溶剂为缓冲液。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备N1-甲基假尿苷三磷酸的方法,其特征在于,以N1-甲基假尿苷为底物,添加酶催化剂和磷酸供体,构建磷酸循环,采用一锅法进行酶催化反应,得到终产物N1-甲基假尿苷三磷酸,所述酶催化反应包括如下阶段:
2. 根据权利要求1所述的制备N1-甲基假尿苷三磷酸的方法,其特征在于,所述N1-甲基假尿苷的浓度为10-50 mmol/L。
3. 根据权利要求1所述的制备N1-甲基假尿苷三磷酸的方法,其特征在于,所述三磷酸腺苷的浓度为1~10 mmol/L。
4. 根据权利要求1所述的制备N1-甲基假尿苷三磷酸的方法,其特征在于,所述乙酰磷酸的浓度为1~200 mmol /L。
5.根据权利要求1所述的制备N1-甲基假尿苷三磷酸的方法,其特征在于,所述焦磷酸硫胺素的浓度为N1-甲基假尿苷浓度的0.1%~2%。
6. 根据权利要求1所述的制备N1-甲基假尿苷三磷酸的方法,其特征在于,所述镁盐的浓度为1 mmol/L~20 mmol/L,所述镁盐为氯化镁、硫酸镁和硝酸镁中的任意一种或多种的组合。
7. 根据权利要求1所述
8.根据权利要求1所述的制备N1-甲基假尿苷三磷酸的方法,其特征在于,所述酶催化反应的温度为30℃~40℃,所述酶催化反应的反应时间为2~28h,所述酶催化反应的pH为6.0~9.0。
...【技术特征摘要】
1.一种制备n1-甲基假尿苷三磷酸的方法,其特征在于,以n1-甲基假尿苷为底物,添加酶催化剂和磷酸供体,构建磷酸循环,采用一锅法进行酶催化反应,得到终产物n1-甲基假尿苷三磷酸,所述酶催化反应包括如下阶段:
2. 根据权利要求1所述的制备n1-甲基假尿苷三磷酸的方法,其特征在于,所述n1-甲基假尿苷的浓度为10-50 mmol/l。
3. 根据权利要求1所述的制备n1-甲基假尿苷三磷酸的方法,其特征在于,所述三磷酸腺苷的浓度为1~10 mmol/l。
4. 根据权利要求1所述的制备n1-甲基假尿苷三磷酸的方法,其特征在于,所述乙酰磷酸的浓度为1~200 mmol /l。
5.根据权利要求1所述的制备...
【专利技术属性】
技术研发人员:黄月园,李杰,张艺,张波琨,卞琪,孙丰来,
申请(专利权)人:泰兴合全药业有限公司,
类型:发明
国别省市:
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