【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程，涉及同时表达幽门螺旋杆菌caga、vaca、ureb和flaa蛋白的重组酿酒酵母菌株及其制备方法和应用。
技术介绍
1、幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori)是一种革兰氏阴性、螺旋状、具有鞭毛的微嗜氧细菌，几乎感染了世界上一半的人口，被列为一级致癌物[1]。幽门螺杆菌感染与消化性溃疡病、十二指肠溃疡和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等一系列胃肠道疾病的发病机制有关，此外这种细菌也是胃癌发生的主要危险因素[2]。
2、质子泵抑制剂、阿莫西林和克拉霉素的标准三联疗法以及近年来的铋剂四联治疗是治疗幽门螺旋杆菌的主要选择[3]。但是感染的高流行率、抗生素治疗的高昂费用以及抗生素耐药性的增加使得开发一种简单、廉价、安全和有效的疫苗非常迫切。病原体产生的多种效应蛋白/毒素都对幽门螺杆菌的毒力和发病机制有贡献，负责对宿主组织造成损害。幽门螺杆菌中最具特征的毒素之一是细胞毒素相关基因a(caga)，caga免疫原性强，存在于菌体表面的外膜蛋白，与胃炎、消化性溃疡和胃癌高风险相关。空泡细胞毒素a(vaca)负责质膜中毛孔的形成和细胞损伤，具有调动宿主免疫系统的强大能力。脲酶b(ureb)是一种负责将尿素转化为氨和二氧化碳的酶，从而使ph值适应病原体的定植，而且不同hp菌株间ureb序列高度保守，分子量大，特异性强，能有效诱导机体产生稳定的免疫保护作用。鞭毛是与幽门螺杆菌运动、逃避和持续定植相关的关键毒力因子。鞭毛素基因a(flaa)是鞭毛整体结构和表面结构中的主要蛋白，除了运动性外还可以诱导炎症和免疫
3、基于单一细菌抗原的疫苗接受幽门螺杆菌菌株区域变异性的机会较低，对机体的刺激不能导致有效的自我保护。因此多种抗原的联合作用可能是开发多价疫苗的一个突破口[5]。酵母表面展示(ysd)技术是一种真核表达系统，利用信号肽引导并锚定外源目的蛋白至酵母细胞表面。ysd结合了真核系统提供的优势，能够进行真核翻译后修饰，同时细胞培养和基因修饰的简便性允许大型复杂蛋白质的正确折叠和分泌。表面展示重组酵母菌株还可以更好地维持肠道菌群平衡和黏膜免疫。此外，展示在酵母细胞表面的蛋白质可能对温度、ph、有机溶剂和蛋白酶的变化表现出更高的稳定性[6]。酿酒酵母(s.cerevisiae)，一种食品级安全酵母底盘，使其成为口服疫苗递送的潜在工具。
4、总之，基于酿酒酵母表面展示技术平台可以快速生产hp交叉抗原以覆盖大量菌株等优势，成为安全、方便使用疫苗研发的新宠，为幽门螺旋杆菌的防控提供了新思路。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种同时表达幽门螺旋杆菌caga、vaca、ureb和flaa蛋白的表面展示型重组酵母，可将其用于口服制剂的研制。
2、本专利技术目的是通过如下技术方案实现的：
3、一种同时表达幽门螺旋杆菌caga、vaca、ureb和flaa蛋白的重组酿酒酵母菌株，st1814g-hp-caga&vaca&ureb&flaa，包含caga蛋白的221位至680位氨基酸，序列特征为seqid no.1；包含vaca蛋白的201位至500位氨基酸，序列特征为seq id no.2；包含ureb蛋白的1位至567位氨基酸，序列特征为seq id no.3，以及包含flaa蛋白的1位至510位氨基酸，序列特征为seq id no.4。
4、构建所述重组酵母的转录单位gpd-caga/vaca/ureb/flaa-tu，序列特征分别为seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7和seq id no.8，由权利要求1所述片段和pot-gpd-tu载体组成。
5、制备同时表达幽门螺旋杆菌caga、vaca、ureb和flaa蛋白的重组酿酒酵母的方法，将体外构建的caga/vaca/ureb/flaa基因完整转录单位gpd-caga/vaca/ureb/flaa-tu，通过同源重组整合于酿酒酵母st1814g基因组，利用aga1-aga2表面展示系统将caga&vaca&ureb&flaa蛋白展示于酵母细胞表面，获得caga&vaca&ureb&flaa蛋白表面展示型的重组酿酒酵母菌株st1814g-hp-caga&vaca&ureb&flaa，并利用所得菌株制备口服重组酿酒酵母。
6、制备同时表达幽门螺旋杆菌caga、vaca、ureb和flaa蛋白的重组酿酒酵母菌株的方法，具体包括以下步骤：
7、(1)编码hp-caga基因的pcr扩增：参考幽门螺旋杆菌caga基因序列ab017923.1，合成优化后的caga基因，序列特征seq id no.9；以pet28a(+)-caga质粒为模板，设计引物扩增caga蛋白编码基因，用于pot-gpd-tu载体连接。
8、(2)编码hp-vaca基因的pcr扩增：参考幽门螺旋杆菌vaca基因序列ay737319.1，合成优化后的vaca基因，序列特征seq id no.10；以pet28a(+)-vaca质粒为模板，设计引物扩增vaca蛋白编码基因，用于pot-gpd-tu载体连接。
9、(3)编码hp-ureb基因的pcr扩增：参考幽门螺旋杆菌ureb基因序列ay714224.1，合成优化后的ureb基因，序列特征seq id no.11；以pet28a(+)-ureb质粒为模板，设计引物扩增ureb蛋白编码基因，用于pot-gpd-tu载体连接。
10、(4)编码hp-flaa基因的pcr扩增：参考幽门螺旋杆菌flaa基因序列ay155231.1，合成优化后的flaa基因，序列特征seq id no.12；以pet28a(+)-flaa质粒为模板，设计引物扩增flaa蛋白编码基因，用于pot-gpd-tu载体连接。
11、(5)编码hp-caga/vaca/ureb/flaa序列与aga2基因串联：通过bamhi单酶切线性化pot-gpd-tu载体，利用无缝克隆分别连接caga、vaca、ureb、flaa基因片段至表面展示表达载体pot-gpd-tu上，将连接产物转化至e.coli top10中，分别用4个基因检测引物进行pcr及测序验证，获得4个重组质粒gpd-caga/vaca/ureb/flaa-tu，其序列特征分别为seq idno.5、seq id no.6、seq id no.7和seq id no.8。
12、(6)caga&vaca&ureb&flaa蛋白酿酒酵母重组菌株的构建：将重组质粒gpd-caga/vaca/ureb/flaa-tu与同源臂urrs、surs、hst2/cip1、adp1s筛选标签leu/trp编码序列进行酶切拼接，以获得含有幽门螺旋杆菌caga&vaca&ureb&flaa基因序列的重组片段，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时表达幽门螺旋杆菌CagA、VacA、UreB和FlaA蛋白的重组酿酒酵母菌株，ST1814G-Hp-CagA&VacA&UreB&FlaA，其特征在于，包含CagA蛋白的221位至680位氨基酸，序列特征为SEQ ID No.1；包含VacA蛋白的201位至500位氨基酸，序列特征为SEQ ID No.2；包含UreB蛋白的1位至567位氨基酸，序列特征为SEQ ID No.3，以及包含FlaA蛋白的1位至510位氨基酸，序列特征为SEQ ID No.4。
2.权利要求1所述重组酿酒酵母的转录单位GPD-CagA/VacA/UreB/FlaA-TU，其特征在于，序列特征分别为SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，由权利要求1所述片段和POT-GPD-TU载体组成。
3.制备同时表达幽门螺旋杆菌CagA、VacA、UreB和FlaA蛋白的重组酿酒酵母的方法，其特征在于，将权利要求2所述体外构建的CagA/VacA/UreB/FlaA基因完整转录单位GPD-CagA/
4.根据权利要求3所述制备同时表达幽门螺旋杆菌CagA、VacA、UreB和FlaA蛋白的重组酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
5.权利要求1所述重组酿酒酵母菌株在制备幽门螺旋杆菌口服制剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种同时表达幽门螺旋杆菌caga、vaca、ureb和flaa蛋白的重组酿酒酵母菌株，st1814g-hp-caga&vaca&ureb&flaa，其特征在于，包含caga蛋白的221位至680位氨基酸，序列特征为seq id no.1；包含vaca蛋白的201位至500位氨基酸，序列特征为seq id no.2；包含ureb蛋白的1位至567位氨基酸，序列特征为seq id no.3，以及包含flaa蛋白的1位至510位氨基酸，序列特征为seq id no.4。
2.权利要求1所述重组酿酒酵母的转录单位gpd-caga/vaca/ureb/flaa-tu，其特征在于，序列特征分别为seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7和seq id no.8，由权利要求1所述片段和pot-gpd-tu载体组成。
3.制备同时表达幽门螺旋杆菌caga、v...
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