【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞模型建立方法，涉及一种双向帕金森病细胞模型的建立方法。
技术介绍
1、帕金森病(parkinson’s disease,pd)是第二大神经系统变性疾病，影响着世界约5千万人口。在65岁以上老年人群中，西方国家患病率为100/10万，中国患病率明显高于西方国家，达170/10万(the epidemiology of parkinson's disease:risk factors andprevention.lancet neurol,2016.15(12):p.1257-1272.)。老化是pd的最重要的危险因素，随着我国进入老龄化社会，pd已成为严重危害我国人群健康的一大主要疾病，因此pd的防治显得尤为重要。慢性进行性黑质多巴胺能神经元变性缺失是pd的主要病理改变，而目前基于增加多巴胺的替代治疗或多巴胺受体激动剂治疗只能暂时缓解临床症状，并不能阻止神经元进行性死亡，延缓疾病进展。因此，探索pd治疗新策略，寻找有效的神经保护新靶点刻不容缓。
2、pd是一种以静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态异常为主要临床特点，以黑质多巴胺能神经元大量变性丢失、残留神经元胞浆中有lewy小体形成为主要病理表现，以脑内多巴胺含量减少、胆碱能系统功能亢进为主要生化改变的神经退行性疾病。线粒体功能障碍会产生严重后果，比如，atp产生减少、氧化物质生成增加、细胞色素c漏出。1970年发现mptp可以导致帕金森病症状及da神经退行性变，人们开始将线粒体功能和pd的发生联系起来。随后研究发现mptp氧化为mpp+，后者可以
3、现有的帕金森模型均为帕金森造模用模型，比如使用鱼藤酮诱导细胞或者实验小鼠产生帕金森，进而实现pd造模。目前已有模型均是单向的，只能诱导细胞或者实验小鼠产生帕金森，而不能反向恢复以去除帕金森症状，这对帕金森的疾病机制研究及药物试验造成了极大困扰。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种双向帕金森病细胞模型的建立方法，解决了现有技术中存在的单向模型只能诱导细胞或者实验小鼠产生帕金森，而不能反向恢复以去除帕金森症状问题。
2、本专利技术所采用的技术方案是，双向帕金森病细胞模型的建立方法，具体按照如下步骤实施：
3、步骤1，建立鱼藤酮诱导sh-sy5y细胞损伤的pd模型，具体为：获取sh-sy5y细胞，将获取的sh-sy5y细胞在培养基中培养，在sh-sy5y细胞对数生长期将鱼藤酮加入培养基，设合适的浓度和作用时间，获得鱼藤酮诱导sh-sy5y细胞损伤的pd模型；
4、步骤2，在步骤1建立的pd模型的基础上上调sirt3表达，具体为：将步骤1获得是鱼藤酮诱导sh-sy5y细胞损伤的pd模型传代于24孔板中，一定的时间后换用新鲜的培养基，然后加入病毒悬液和转染增强液转染一定的时间后在显微镜下观察绿色荧光表达，嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株并用western blot验证sirt3过表达慢病毒转染成功。
5、本专利技术的特征还在于，
6、步骤1中将获取的sh-sy5y细胞在培养基中培养具体为：
7、将获取的sh-sy5y细胞放置于培养基中在温度为35-38℃、4-5％ co2条件下进行培养。
8、步骤1中的培养基为包含10％胎牛血清的dmem-f12培养基。
9、步骤1中培养基中加入鱼藤酮的浓度为9μm-15μm，培养时间为10-48小时。
10、步骤1获得是鱼藤酮诱导sh-sy5y细胞损伤的pd模型传代于24孔板中，2-48小时后换用新鲜的培养基。
11、步骤2具体为：步骤2中加入的病毒悬液为moi值为5-30的病毒悬液，新鲜的培养基和病毒悬液的体积比为：10ml：0.1-1ml。
12、步骤2中加入病毒悬液和转染增强液后的培养条件为：35-38℃恒温培养箱中转染10-72小时。
13、转染增强液为浓度为1-20μg/ml的聚凝胺或阳离子多肽或纳米氨基聚合物，新鲜的培养基和转染增强液的体积比为10ml：0.5-3ml。
14、新鲜的培养基包括浓度为100-800mg/l氨基酸、浓度为0.1-1.0mg/l的维生素、浓度为0.1-10mg/l的无机离子。
15、浓度为100-800mg/l氨基酸、浓度为0.1-1.0mg/l的维生素、浓度为0.1-10mg/l的无机离子按照体积比为10-5：5-2：3-1混合，形成新鲜的培养基。
16、本专利技术的有益效果是：
17、本专利技术的方法建立帕金森病细胞模型在诱导产生帕金森之后，可以通过基因转染减缓帕金森症状，这种双向帕金森模型的建立方法为帕金森疾病机制的深入研究及治疗药物试验提供一种可行的策略，同时可为帕金森病提供一种可行、可信的治疗方法或药物靶点。
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1.双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，具体按照如下步骤实施：
2.根据权利要求1所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1中将获取的SH-SY5Y细胞在培养基中培养具体为：
3.根据权利要求2所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1中的培养基为包含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基。
4.根据权利要求3所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1中培养基中加入鱼藤酮的浓度为9μM-15μM，培养时间为10-48小时。
5.根据权利要求4所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，将步骤1获得是鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤的PD模型传代于24孔板中，2-48小时后换用新鲜的培养基。
6.根据权利要求5所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，所述步骤2具体为：所述步骤2中加入的病毒悬液为MOI值为5-30的病毒悬液，所述新鲜的培养基和病毒悬液的体积比为：10mL：0.1-1mL。
7.根据权利要求6所述的双向帕金森病细胞模型的
8.根据权利要求7所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，所述转染增强液为浓度为1-20μg/mL的聚凝胺或阳离子多肽或纳米氨基聚合物，所述新鲜的培养基和转染增强液的体积比为10mL：0.5-3mL。
9.根据权利要求8所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，所述新鲜的培养基包括浓度为100-800mg/L氨基酸、浓度为0.1-1.0mg/L的维生素、浓度为0.1-10mg/L的无机离子。
10.根据权利要求9所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，所述浓度为100-800mg/L氨基酸、浓度为0.1-1.0mg/L的维生素、浓度为0.1-10mg/L的无机离子按照体积比为10-5：5-2：3-1混合，形成新鲜的培养基。
...【技术特征摘要】
1.双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，具体按照如下步骤实施：
2.根据权利要求1所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1中将获取的sh-sy5y细胞在培养基中培养具体为：
3.根据权利要求2所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1中的培养基为包含10％胎牛血清的dmem-f12培养基。
4.根据权利要求3所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1中培养基中加入鱼藤酮的浓度为9μm-15μm，培养时间为10-48小时。
5.根据权利要求4所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，将步骤1获得是鱼藤酮诱导sh-sy5y细胞损伤的pd模型传代于24孔板中，2-48小时后换用新鲜的培养基。
6.根据权利要求5所述的双向帕金森病细胞模型的建立方法，其特征在于，所述步骤2具体为：所述步骤2中加入的病毒悬液为moi值为5-30的病毒悬液，所述新鲜的培养基和病毒悬液的体积比...
【专利技术属性】
技术研发人员：张萌，曹红梅，胡宁薇，屈秋民，邓永宁，
申请(专利权)人：西安交通大学医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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