【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，尤其涉及一种hrp-生物素双修饰的ssdnareporter及其应用。
技术介绍
1、目前，作为基因组编辑的重要工具，crispr/cas系统具有靶序列特异性识别功能。某些cas同源物如cas13和cas12a在目标序列特异性的识别后还会激活非特异性的内切酶活性(trans活性)。更重要的是，作为一种可编程核酸酶，crispr/cas12a的靶标特异性可以通过简单调整其反应体系中grna的序列来实现。本质上来说crispr/cas12a反应天然本质上可以选择针对任意核酸序列。基于这一原理，crispr/cas系统已经广泛应用于核酸检测。在早期开发的平台(如detectr和sherlock)中，等温扩增技术与crispr/cas12a、cas13a和cas14的结合不仅有助于在阿托摩尔水平(am)上高度敏感地检测目标序列，还允许对这些目标序列中的基因型和单核苷酸多态性(snp)进行区分。近年来，crispr/cas系统已广泛用于开发高灵敏度的检测方法，针对各种目标，如寨卡病毒(zikv)、登革病毒(denv)、sars-cov-2、非洲猪瘟病毒(asfv)等。然而，在上述crispr/cas检测方法中实现高灵敏度需要进行靶标序列的预扩增步骤。这不仅延长了检测时间线，还引入了大量意外的靶标序列，类似于前面提到的pcr方法，因此存在气溶胶污染的风险。
2、辣根过氧化物酶(hrp)能够高效催化其底物的降解反应，从而产生颜色或荧光反应。这种颜色或荧光的强度与反应中存在的hrp的数量高度相关。这一特性使得
3、狼牙病毒(layv)属于亨尼帕病毒(henipaviruses)，这类病毒中比较有名的包括亨德拉病毒和尼帕病毒。目前针对亨尼帕病毒的核酸检测方法主要包括病毒分离、免疫学方法和核酸检测方法。其中，病毒分离是病毒检测的金标准。但这种方法费时费力，且对于高致病性病原，病毒分离需在bsl-4实验室(生物安全四级实验室)进行；免疫学方法中的elisa(enzyme-linked immunosorbent assays，elisa，酶联免疫吸附试验)曾在亨德拉病毒和尼帕病毒大流行中被广泛应用，但elisa方法灵敏度欠佳；pcr(聚合酶链式反应)一类基于核酸扩增的检测方法具有高度的灵敏度和特异性，是目前最常用的方法。但pcr方法需要精密且昂贵的温度循环设备(pcr仪)，难以在不同实验条件的地区广泛推广。并且pcr这类基于核酸扩增的方法极易造成实验环境中目标核酸片段的气溶胶污染，对后续的检测造成假阳性结果。同时，现有的核酸检测方法也仅限于亨尼帕病毒的其他成员，并无狼牙病毒的特异性核酸诊断方法。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种hrp-生物素双修饰的ssdna reporter及其应用。
2、第一方面，本专利技术提供了一种hrp-生物素双修饰的ssdna reporter，所述hrp-生物素双修饰的ssdna reporter是采用点击化学方式将dbco-生物素双修饰的ssdnareporter和hrp进行偶联所得。
3、第二方面，本专利技术提供了第一方面hrp-生物素双修饰的ssdna reporter在制备crispr/cas检测系统中的应用，所述hrp-生物素双修饰的ssdna reporter起到crispr/cas检测系统的信号输出放大的作用。
4、进一步地，所述crispr/cas检测系统不进行核酸预扩增环节。
5、第三方面，本专利技术提供了一种用于目标核酸片段检测的hrp增强型crispr/cas12a检测体系，所述hrp增强型crispr/cas12a检测体系包括cas12a反应体系、hrp修饰reporter及其包被的反应器皿和显色试剂；
6、所述hrp修饰reporter包被反应器皿是通过亲和素包被的反应器皿和hrp-生物素双修饰的ssdna reporter通过生物素-亲和素系统特异性结合所得；
7、所述hrp-生物素双修饰的ssdna reporter是采用点击化学方式将dbco-生物素双修饰的ssdna reporter和hrp进行偶联所得。
8、进一步地，所述cas12a反应体系包括以下组分：如nebuffer 2.1(10x)等反应缓冲液、cas12a蛋白质、grna、二硫苏糖醇和ddh2o。
9、进一步地，所述hrp-生物素双修饰的ssdna reporter的制备方法包括以下步骤：
10、将hrp溶解于碳酸氢钠溶液中，得到hrp溶液；
11、将azido-peg-nhs ester加入所述hrp溶液中进行室温搅拌反应，反应结束后进行过滤和洗涤，得到azide修饰的hrp；
12、将所述azide修饰的hrp和dbco-生物素双修饰的ssdna reporter进行室温摇动反应，反应结束后进行过滤和洗涤，得到所述hrp-生物素双修饰的ssdna reporter。
13、进一步地，所述亲和素包被的反应器皿包括亲和素包被的96孔板。
14、进一步地，所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等，所述显色试剂包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)。
15、进一步地，所述hrp增强型crispr/cas12a检测体系应用病原微生物检测时，无需进行核酸预扩增环节。
16、第四方面，本专利技术提供了第一方面任一项所述的hrp增强型crispr/cas12a检测体系在制备病毒检测产品中的应用，所述病毒包括狼牙病毒、寨卡病毒、登革病毒、sars-cov-2和非洲猪瘟病毒。
17、第五方面，本专利技术提供了一种用于目标核酸片段检测的生物传感器，所述用于目标核酸片段检测的生物传感器包括第一方面任一项所述的hrp增强型crispr/cas12a检测体系，所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等。
18、第六方面，本专利技术提供了一种用于目标核酸片段检测的试剂盒，所述用于目标核酸片段检测的试剂盒包括第一方面任一项所述的hrp增强型crispr/cas12a检测体系，所述目标核酸片段包含但不限于狼牙病毒、甲型流感病毒及牙龈卟啉单胞菌等病毒及细菌性病原核酸等。
19、第七方面，本专利技术提供了一种用于目标核酸片段检测的方法，所述检测方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter，其特征在于，所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter是采用点击化学方式将DBCO-生物素双修饰的ssDNA reporter和HRP进行偶联所得。
2.权利要求1所述的HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter在制备CRISPR/Cas检测系统中的应用，其特征在于，所述HRP-生物素双修饰的ssDNA reporter起到CRISPR/Cas检测系统的信号输出放大的作用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas检测系统不进行核酸预扩增环节。
4.一种用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于，所述HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系包括Cas12a反应体系、HRP修饰reporter包被反应器皿和显色试剂；
5.权利要求4所述的用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于，所述Cas12a反应体系包括以下组分：反应缓冲液、Cas12a蛋白质、gR
6.权利要求4所述的用于目标核酸片段检测的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于，所述HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系应用病原微生物检测时，无需进行核酸预扩增环节。
7.权利要求4～6任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系在制备病原微生物检测产品中的应用。
8.一种用于目标核酸片段检测的生物传感器，其特征在于，所述用于目标核酸片段检测的生物传感器包括权利要求4～6任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系。
9.一种用于目标核酸片段检测的试剂盒，其特征在于，所述用于目标核酸片段检测的试剂盒包括权利要求4～6任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系。
10.一种用于目标核酸片段检测的方法，其特征在于，所述检测方法采用权利要求4～6任一项所述的HRP增强型CRISPR/Cas12a检测体系。
...【技术特征摘要】
1.一种hrp-生物素双修饰的ssdna reporter，其特征在于，所述hrp-生物素双修饰的ssdna reporter是采用点击化学方式将dbco-生物素双修饰的ssdna reporter和hrp进行偶联所得。
2.权利要求1所述的hrp-生物素双修饰的ssdna reporter在制备crispr/cas检测系统中的应用，其特征在于，所述hrp-生物素双修饰的ssdna reporter起到crispr/cas检测系统的信号输出放大的作用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述crispr/cas检测系统不进行核酸预扩增环节。
4.一种用于目标核酸片段检测的hrp增强型crispr/cas12a检测体系，其特征在于，所述hrp增强型crispr/cas12a检测体系包括cas12a反应体系、hrp修饰reporter包被反应器皿和显色试剂；
5.权利要求4所述的用于目标核酸片段检测的hrp增强型crispr/cas12a检测体系，其特征在于，所述cas12a...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴暄，李毅，向荣，
申请(专利权)人：遵义医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：
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