本发明专利技术涉及基于CRISPR‑Cas9系统的Galt基因敲除小鼠模型、构建方法及应用，涉及动物基因工程技术领域，包括如下的步骤：步骤1：设计靶向Galt基因的sgRNA；步骤2：体外转录制备的sgRNA和Cas9mRNA，一起显微注射到小鼠受精卵中，然后移植到代孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行PCR鉴定，将阳性F0代连续繁殖至少2代，筛选获得Galt基因敲除小鼠模型；所述sgRNA1序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术针对小鼠Galt基因的9号外显子设计了sgRNA，并利用CRISPR‑Cas9系统，成功构建了Galt基因敲除小鼠模型，Galt基因在转录的时候发生移码突变，GALT蛋白无法正确翻译，进而模拟人类经典半乳糖血症，为探索人类经典半乳糖血症的发生和发展机理、发现药物新靶点以及临床前药效学评价等生物医学研究奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物基因工程，具体涉及基于crispr-cas9系统的galt基因敲除小鼠模型、构建方法及应用。
技术介绍
1、crispr-cas9系统是根据自然界中抵抗噬菌体感染和质粒转移的细菌防御机制改造而来的基因编辑工具，可作用于基因组编辑、转录干扰、表观遗传调节和基因组成像。crispr-cas9系统不仅价格低廉、操作简单、编辑效率高，而且它造成dna双链断裂(dsb)后既可以通过同源定向修复(hdr)进行精准基因编辑，又可以通过非同源末端连接(nhej)进行随机的基因编辑。基于此，科研人员利用crispr-cas9系统构建许多细胞或动物疾病模型来研究基因功能和基因调控，如基因敲除人肠组织衍生类肠细胞系、tsc2-ko nih-3t3细胞系、肌营养不良症猪模型、阿尔茨海默症小鼠模型等，并从中取得了一定的研究进展。
2、半乳糖血症(galactosemia,gal,omim#230440)是由于半乳糖leloir代谢途径中关键酶失活或功能异常所引起的常染色体隐性遗传代谢病，包括i型、ii型和iii型，分别由半乳糖-1磷酸-尿苷转移酶、半乳糖激酶以及尿苷二磷酸-半乳糖-4'-表异构酶异常所引起。i型半乳糖血症，(type igalactosamia,gal i,omim#230400)又称经典半乳糖血症(classic galactosemia)，其患病率为1/30000～1/60000，在三种半乳糖血症中发病率最高。半乳糖对人体至关重要，具有广泛的功能，是婴儿断奶前的关键能量来源，对早期发育尤为重要。
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p>3、gal i在新生儿时期表现为一种潜在的致死性疾病，可导致慢性衰弱并发症，如果不及时治疗，可致新生儿死亡。gal i的临床症状可分为急性症状和慢性并发症。急性症状是由于胎儿出生后摄取乳汁中乳糖，乳糖代谢异常导致肝大、肝硬化等肝损伤，随后出现白内障及肾小管功能不全等症状，严重威胁生命。乳糖和半乳糖饮食限制治疗后，可有效缓解gal i的急性症状，然而并不能解决gal i的慢性并发症。慢性并发症主要为神经系统和生殖系统病变，表现为语言障碍、运动失调以及卵巢功能不全等。目前，限制病人饮食摄入乳糖和半乳糖是主要的治疗措施，尚无其他治疗办法。为此，研究者试图通过研制特异性抗体和分子保护剂等药物治疗gal i，然而并未找到理想的治疗办法。鉴于此，本专利技术提供基于crispr-cas9系统的galt基因敲除小鼠模型、构建方法及应用。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供基于crispr-cas9系统的galt基因敲除小鼠模型、构建方法及应用。目的是利用crispr-cas9系统构建galt基因敲除小鼠，旨在建立模拟人类gal i疾病的小鼠模型，为探索gal i发生和发展机理、发现药物新靶点以及临床前药效学评价等生物医学研究奠定基础。
2、本专利技术为了解决上述技术问题，第一个方面提供了基于crispr-cas9系统的galt基因敲除小鼠模型的构建方法，包括如下的步骤：
3、步骤1:基于crispr-cas9系统设计靶向galt基因的sgrna；
4、步骤2:sgrna与cas9经体外转录后的mrna一起显微注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到代孕母鼠体内，产出f0代，对f0代进行pcr鉴定，将阳性f0代连续的繁殖至少2代，筛选获得galt基因敲除小鼠模型；其中，所述sgrna序列如seq id no：1所示。
5、本专利技术采用galt基因采用小鼠galt-201(ensmust00000084695.12)转录本中作为编辑转录本，galt-201转录本(ensmust00000084695.12)全长3.47kb，其中包含11个外显子(exons)，10个内含子(introns)。
6、本专利技术的有益效果是：本专利技术针对经典半乳糖血症galt基因的致病位点galt 9号外显子设计了sgrna，并利用crispr-cas9系统，将sgrna、cas9 mrna共注射受精卵，成功构建了galt基因敲除小鼠模型，galt基因在转录的时候发生移码突变，galt蛋白无法正确翻译，通过上述的步骤成功构建了galt基因敲除小鼠模型，并通过繁育得到了纯合子。
7、上述鉴定获得galt基因敲除小鼠模型，具体的鉴定方法包括采用qpcr、wb等实验检测galt基因敲除小鼠galt基因的表达水平，同时对galt基因敲除小鼠和野生型小鼠的体重进行记录，通过病理学切片实验进一步分析模型小鼠的相关表型，并得出以下结论：
8、(1)通过qpcr实验、wb实验对galt mrna表达水平以及galt蛋白表达水平进行检测，实验结果表明：galt基因敲除小鼠的galt mrna、galt蛋白质表达水均明显低于野生型小鼠，并具有统计学差异。
9、(2)在小鼠生长前15周，野生型小鼠的体重略高于galt基因敲除小鼠。
10、(3)通过石蜡切片he染色对主要组织器官进行病理学和组织形态学上的分析，结果发现，和野生型小鼠相比，gal基因敲除小鼠的心脏、脾脏、肾脏组织均无异常，而gal基因敲除小鼠的肝脏出现了不同程度的水肿，肺脏也出现了损伤。
11、在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
12、进一步，所述阳性f0代小鼠galt基因的cdna序列上第829位至837位碱基被敲除，并插入了1个碱基t，所述galt基因的其它核苷酸序列保持不变。
13、上述缺失的dna序列位于galt基因9号外显子上，导致其在转录的时候发生移码突变，galt蛋白无法正确翻译。
14、进一步，所述步骤2包括以下具体的步骤：
15、步骤21，小鼠促排卵和体外受精得到小鼠受精卵；
16、步骤22，将sgrna与cas9 mrna经体外转录后，一起显微注射到所述小鼠受精卵的胞质中，得到注射后受精卵；
17、步骤23，将所述注射后受精卵移植入代孕母鼠的输卵管内，发育完成后，得到f0代小鼠，对f0代进行pcr鉴定，将阳性f0代与野生型小鼠交配获得f1代杂合子，f1代杂合子进行杂交，筛选galt基因敲除的纯合子代，作为galt基因敲除小鼠模型。
18、进一步，用于所述pcr鉴定的特异性引物包括：galt-m-es-1，galt-m-ea-1，galt-m-is-1和galt-m-ia-1；所述galt-m-es-1序列如seq id no:3所示，所述galt-m-ea-1序列如seq id no:4所示，所述galt-m-is-1序列如seq id no:5所示，所述galt-m-ia-1序列如seq id no:6所示。
19、进一步，所述sgrna与cas9 mrna质量比为(0.9-1.1)。
20、进一步，所述小鼠单受精卵的供体为c57bl/6j小鼠；所述代孕母鼠为icr小鼠。
21、第二个方面提供了基于crispr-cas本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.基于CRISPR-Cas9系统的Galt基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下的步骤：
2.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9系统的Galt基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述阳性F0代小鼠Galt基因的cDNA序列上第829位至837位碱基被敲除，并插入了1个碱基T，所述Galt基因的其它核苷酸序列保持不变。
3.根据权利要求1或2所述基于CRISPR-Cas9系统的Galt基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤2包括以下具体的步骤：
4.根据权利要求3所述基于CRISPR-Cas9系统的Galt基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，用于所述PCR鉴定的特异性引物包括：Galt-M-ES-1，Galt-M-EA-1，Galt-M-IS-1和Galt-M-IA-1；所述Galt-M-ES-1序列如SEQ ID NO:3所示，所述Galt-M-EA-1序列如SEQID NO:4所示，所述Galt-M-IS-1序列如SEQ ID NO:5所示，所述Galt-M-IA-1序列如SEQ IDNO:6所示。p>
5.根据权利要求3所述基于CRISPR-Cas9系统的Galt基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA与所述Cas9经体外转录后的mRNA质量比为1:(0.9-1.1)。
6.根据权利要求3所述基于CRISPR-Cas9系统的Galt基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述受精卵的供体为C57BL/6J小鼠；所述代孕母鼠为ICR小鼠。
7.基于CRISPR-Cas9系统的Galt基因敲除小鼠模型，其特征在于，所述Galt基因敲除小鼠模型由如权利要求1至6任一项所述的构建方法制备得到。
8.一种用于构建如权利要求7所述基于CRISPR-Cas9系统的Galt基因敲除小鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括所述sgRNA和所述Cas9经体外转录后的mRNA。
9.一种权利要求7所述Galt基因敲除小鼠模型或权利要求8所述试剂盒的应用，其特征在于，用于开发和/或筛选治疗I型半乳糖血症的物质。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述物质为药物。
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【技术特征摘要】
1.基于crispr-cas9系统的galt基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下的步骤：
2.根据权利要求1所述基于crispr-cas9系统的galt基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述阳性f0代小鼠galt基因的cdna序列上第829位至837位碱基被敲除，并插入了1个碱基t，所述galt基因的其它核苷酸序列保持不变。
3.根据权利要求1或2所述基于crispr-cas9系统的galt基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤2包括以下具体的步骤：
4.根据权利要求3所述基于crispr-cas9系统的galt基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，用于所述pcr鉴定的特异性引物包括：galt-m-es-1，galt-m-ea-1，galt-m-is-1和galt-m-ia-1；所述galt-m-es-1序列如seq id no:3所示，所述galt-m-ea-1序列如seqid no:4所示，所述galt-m-is-1序列如seq id no:5所示，所述galt-m-ia-1序列如seq ...
【专利技术属性】
技术研发人员：于鸿浩，付灿，岳鹏鹏，李勇，辜澜涛，杨玲玲，
申请(专利权)人：桂林医学院，
类型：发明
国别省市：
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