【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，尤其涉及一种用于cas12a荧光检测系统的增强剂及其应用。
技术介绍
1、牙周炎是由细菌引起的牙周组织的炎症性疾病，在全世界范围内广泛流行。据估计，牙周炎影响了高达90％的世界人口。牙周炎可引起牙齿周围的牙槽骨进行性丢失，进而造成牙齿松动甚至脱落。牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)fimaii和iv型菌株是与慢性牙周炎高度相关，可在高达85％的疾病部位检测到，被认为是口腔生物被膜的“基石”。此外，动物实验和人群临床数据调查发现，牙周炎还与糖尿病、心血管疾病、类风湿性关节炎、中风和不良妊娠之间存在关联。因此，可靠的早期牙周病原检测不仅能有效的预防牙周炎，还能为患者的健康带来更多的益处。
2、目前常用的牙龈卟啉单胞菌检测方法主要包括分离培养、抗体和核酸检测方法。分离培养虽为病原检测的“金标准”，但执行过程费时费力，不能适应现在快节奏的临床诊断；且分离培养需要专门的实验室和设备，无法用于口腔病原的椅边检测。抗体检测方法目前应用最多的为elisa方法。相比于分离培养，elisa利用抗原-抗体特异性结合检测病原，更加快捷，且具有一定的特异性，但灵敏度不足。核酸检测方法则比elisa方法具有更高的灵敏度，以pcr为代表的各类核酸检测方法已广泛地应用于各种病原的检测，且实时荧光定量pcr(real-time pcr，rt-pcr)能够对样品中病原靶序列的拷贝数进行定量检测。在hamlet的研究中，rt-pcr最低可检测到样品中102拷贝牙龈卟啉单胞菌核酸，远灵敏于elisa的
3、成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspacedpalindromic repeats，crispr)及crispr相关蛋白(crispr associated protein，cas)构成的crispr-cas系统在原核生物抵御噬菌体攻击的过程中起到至关重要的作用。cas家族有众多成员，可分为两类：第一类cas蛋白负责采集入侵者的rna或dna，从而产生记忆，当外源序列再次入侵细胞时产生预期精确互补的引导rna(guide rna，grna)；第二类cas蛋白则可在grna的指导下，特异性地对已产生记忆的rna或dna靶片段进行切割，从而沉默外源基因的表达，抵御噬菌体的干扰。由于这种精确靶向功能，crispr-cas不仅被用作靶向基因编辑，也同样在核酸快速检测领域有广泛应用。
4、近年来，cas12和cas13 trans内切酶活性的发现大大推动了crispr-cas系统在生物传感器开发中的应用。在grna的介导下，cas12和cas13等核酸内切酶在识别并切割dna或rna靶序列的同时，其非特异性内切酶活性(称为trans裂解活性)也会被激活，从而对反应体系中ssdna或ssrna进行非靶向切割。cas12/13系统被用于特定靶序列检测时，由于trans裂解活性被靶序列激活后可不断的进行trans切割，因此，当引入供trans切割的报告ssdna或ssrna分子时，由报告ssdna或ssrna裂解产生的信号会随着时间不断被放大，即使在仅有少量靶序列时也能产生强烈的信号。基于此原理的众多生物传感器，例如sherlock、detecter、sherlockv2等，已被广泛用于多种病原的核酸检测。然而现有的基于crispr-cas的生物传感器的高灵敏度都强烈依赖于cas反应上游的靶序列预扩增。这不仅增加了检测流程的时间和复杂性，预扩增带获得大量靶序列还成为实验室条件下靶序列气溶胶污染的主要来源。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种用于cas12a荧光检测系统的增强剂及其应用。
2、第一方面，本专利技术提供了一种用于cas12a荧光检测系统的增强剂，所述用于cas12a荧光检测系统的增强剂是由一段双链区(14bp)和一段单链区(5nt)构成的环状dna；
3、所述双链区与所述cas12a荧光检测系统中的rnp所识别的靶序列完全一致；
4、所述单链区为被cas12a trans切割的poly t。
5、进一步地，用于cas12a荧光检测系统的增强剂的序列包括：15-20bp dsdna+1～5nt ssdna，且dsdna序列与cas12a rnp grna序列互补。
6、进一步地，所述用于cas12a荧光检测系统的增强剂的序列包括chain 1和chainc；其中，所述chain 1由5’到3’依次包括biontin-ttttt/azide-dt/第一序列-chch，所述第一序列如seq id no.1所示；所述chain c如seq id no.2所示。
7、进一步地，所述chain 1通过点击化学形成环状结构；所述chain c和所述chain 1为互补序列。
8、进一步地，所述用于cas12a荧光检测系统的增强剂的制备方法包括以下步骤：
9、采用牛血清白蛋白溶液对链霉亲和素修饰磁珠进行封闭，得到封闭后的磁珠；
10、将封闭后的所述磁珠和chain 1ssdna寡核苷酸进行第一孵育，然后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗磁珠，得到第一孵育后的磁珠；
11、将第一孵育后的所述磁珠、二价铜盐、硫醇类还原剂和配体进行第二孵育，使chain 1成环；随后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗并加入核酸外切酶vii，以去除未成环的chain 1ssdna，得到结合有通过点击化学形成环状结构chain 1的磁珠；
12、采用磷酸盐缓冲溶液对结合有通过点击化学形成环状结构chain 1的所述磁珠进行清洗并加热，使结合于亲和素的环状dna释放至上清液，收集上清液并测定环化ssdna的浓度，然后将等摩尔量的环状ssdna和chain c混合，制得所述用于cas12a荧光检测系统的增强剂。
13、进一步地，所述二价铜盐包括cuso4；所述硫醇类还原剂包括三(2-羧乙基)膦；所述配体包括叔丁基三氯乙酰亚胺酯。
14、第二方面，本专利技术提供了第一方面任一项所述的用于cas12a荧光检测系统的增强剂的应用，所述应用包括：
15、(a)制备cas12a荧光检测系统；
16、(b)制备生物传感器；
17、(c)口腔病原菌核酸检测。
18、第本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂是由一段双链区和一段单链区构成的环状DNA；
2.权利要求1所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的序列包括chain 1和chain c；其中，所述chain 1由5’到3’依次包括Biontin-TTTTT/Azide-dT/第一序列-CHCH，所述第一序列如SEQ ID NO.1所示；所述chain c如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求2所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述chain1通过点击化学形成环状结构；所述chain c和所述chain 1为互补序列。
4.根据权利要求1～3任一项所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，所述二价铜盐包括CuSO4；所述硫醇类还原剂包括三(2-羧乙基)膦；所述
6.权利要求1～5任一项所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的应用，其特征在于，所述应用包括：
7.一种用于口腔病原菌核酸检测的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括权利要求1～5任一项所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂。
8.根据权利要求7所述的用于口腔病原菌核酸检测的生物传感器，其特征在于，所述口腔病原菌包括牙龈卟啉单胞菌、Prevotella melaninogenica(ATCC 33270)、Campylobacter rectus(ATCC 33238)、Streptococcus sanguinis(ATCC 10556)、Streptococcus mutans(ATCC 700611)、Peptostreptococcus micros(ATCC 33270)、Treponema denticola(ATCC 35405)、Prevotella intermedia(ATCC 25611)、Porphyromonas endodontalis(ATCC 35406)。
...【技术特征摘要】
1.一种用于cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述用于cas12a荧光检测系统的增强剂是由一段双链区和一段单链区构成的环状dna；
2.权利要求1所述的用于cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述用于cas12a荧光检测系统的增强剂的序列包括chain 1和chain c；其中，所述chain 1由5’到3’依次包括biontin-ttttt/azide-dt/第一序列-chch，所述第一序列如seq id no.1所示；所述chain c如seq id no.2所示。
3.权利要求2所述的用于cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述chain1通过点击化学形成环状结构；所述chain c和所述chain 1为互补序列。
4.根据权利要求1～3任一项所述的用于cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述用于cas12a荧光检测系统的增强剂的制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的用于cas12a荧光检测系统的增强剂，所述二价铜盐包括cuso4；所述硫醇类还原剂包括三(2-羧乙基)膦；...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴暄，李毅，向荣，皮宁宁，
申请(专利权)人：遵义医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：
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