一种类固醇类环境内分泌干扰物羟基酮基同步衍生化方法技术

一种类固醇类环境内分泌干扰物（雌酮、１７β－雌二醇、１７α－乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮）的羟基酮基同步衍生化方法，其步骤为：首先取含有类固醇类环境内分泌干扰物以及内标的标准混合溶液于常温下通入高纯氮气吹干，加入以Ｎ－甲基－Ｎ－三甲基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷与二硫赤藓糖醇配成的比例为１０００μＬ∶５～１０μＬ∶５ｍｇ衍生化试剂，在２０～６０℃下反应５～１０ｍｉｎ，以得到衍生化产物，如附图。该方法具有操作简便、省时、能耗和成本低等优点。可将羟基酮基同步衍生化，各衍生化产物线性相关性良好，仪器检出限可达０．０１～１ｐｇ／μＬ，可应用于水体、底泥、生物等样品中类固醇类环境内分泌干扰物的ＧＣ－ＭＳ检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属环境分析化学领域，是一种涉及类固醇类环境内分泌干扰物(雌酮、 17 3 -雌二醇、雌三醇、17 a -乙炔基雌二醇和孕酮)的羟基酮基同步衍生化方法，是气相色 谱_质谱联用仪用于分析此类物质的样品前处理方法和核心技术。
技术介绍
环境内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs)又称环境激素 (Environmental Hormones)，是指环境中天然存在或人为排放的，能够通过模拟动物或人 体内的生理生化作用，起到干扰或抑制内分泌系统，并对生殖、神经和免疫系统功能产生影 响的一大类外源性化合物。EDCs具有很强的毒性和生物蓄积性，可通过饮用水和食物链富 集来干扰动物和人类的内分泌系统，在极低浓度下即对生物体产生严重危害。类固醇类环 境内分泌干扰物(Steroids Endocrine Disrupting Chemicals)是EDCs 的一种，是由胆固 醇合成的一种生物活性物质。这类物质化学性质稳定，难以分解，易于在生物体内富集，相 对其他EDCs，有更强的内分泌干扰作用。所以，类固醇类环境内分泌干扰物的研究已成为国 际环境分析化学领域的前沿和热点课题之一。现今，涉及类固醇类环境内分泌干扰物的分析检测方法很多，但就世界范围来 说还处于起步阶段，没有现成的标准分析方法。在实际工作中，气相色谱-质谱联用法 (GC-MS)以其良好的检测灵敏度，避免过多的溶剂浪费，相对快速的分析过程和较低的运行 成本而受到环境痕量分析工作者的青睐。但是由于类固醇类环境内分泌干扰物本身的弱挥 发性和热不稳定性，加之含有羟基，酮基等极性官能团，直接用GC-MS分析，在气相色谱柱 内容易产生吸附，从而使检出值偏低，灵敏度下降，不利于痕量分析。GC-MS分析此类物质通 常需通过衍生化技术，将其转化成极性较低，更易挥发且热稳定性好的衍生化产物，从而提 高检测灵敏度和改善色谱峰形，达到痕量分析的要求。在衍生化技术研究领域中，类固醇类环境内分泌干扰物单羟基衍生化技术已经取 得一定成果，主要采用三甲基硅烷化(TMS)衍生化技术，研究内容全面，基本满足应用要 求。相比之下，类固醇类环境内分泌干扰物的酮基以其自身的性质决定其衍生化难度高于 羟基，研究酮基衍生化的工作开展较少。因为酮基衍生化研究的匮乏，导致一次性分析含 有羟基与酮基的多组分的工作难于开展。目前，国际上羟基酮基同步衍生化技术发展也有 研究，但其开发极不完善，反应条件差别很大，应用试剂种类繁多。在国内外论文报道的各 种能够同步衍生化羟基酮基的试剂中，以硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺 (N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroa-cetamide, MSTFA)为基质，加入催化剂(三 甲基碘硅烷(Trimethyliodosilane, TMIS)或碘化铵(Ammonium iodide, NH4I))与还原剂 (二硫赤藓糖醇(DithioerythreitoLDTE)或乙硫醇(ethanethiol))为最常用的衍生化试 剂，但此类方法研究主要集中在临床医学与兴奋剂检测领域，检测物质也很少涉及类固醇 类环境内分泌干扰物，绝大多数检测的物质在结构上与类固醇类内分泌干扰物结构相近， 有一定的参考价值。如Hartman (Hartmann S，Steinhart H. Journal of ChromatographyB，1997,704(1/2) :105 117)应用 MSTFA/TMIS/DTE(1000 2 2，v/v/w)为衍生化试 剂，在反应条件60°C持续15min，检测肉类中雄激素、雌激素、孕激素及其代谢产物时指出， GC-MS检测的灵敏性明显高于单羟基硅烷化法；Magnisali(MagnisaliP，Dracopoulou M， Mataragas M, Dacou—Voutetakis A, Moutsatsou P. Journal of Chromatography A,2008, 1206(2) :166 177)也采用MSTFA/TMIS/DTE，在80°C，35min条件下对类固醇类物质进 行衍生化。目前，关于类固醇类环境内分泌干扰物的羟基酮基同步衍生化在国内尚无专 利。国际上，羟基酮基同步衍生化技术近年也开始应用于环境领域，如Aerni(H.R.Aerni， B. Kobler, B. V. Rutishauser, et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2004, 378(7) 1873 1873)禾口 Rutishauser(B. V. Rutishauser，M. Pesonen, B. I. Escher, et al.Environmental Toxicology and Chemistry，2004，23(4)857 864)以 MSTFA/TMIS/ DTE (1000 2 2, v/v/w)检测污水中类固醇类环境内分泌干扰物，但以上应用对反应条 件要求较高，实验过程比较繁琐。通过对食品安全，兴奋剂检测以及环境领域的综合研究发现，羟基酮基同步衍生 化法存在的不足主要是目前所应用的羟基酮基衍生化法过程过于繁琐，至今对衍生化方 法缺乏系统研究。缺乏针对典型类固醇类环境内分泌干扰物的羟基酮基衍生化法。衍生化 反应需要在加热的条件下进行，加热温度为60 80°C，加热时间为15min lh，催化剂加 入量差别较大，这都使得衍生化实验能耗和成本上升，实验时间较长，在实际环境样品检测 中，加大了样品流失，降低了检测准确度。所以，本专利技术以环境中贡献量较大且极具危害的五种典型类固醇类环境内分泌干 扰物作为研究对象，包括生物体内天然存在的雌酮(Estrone，El)、17 0-雌二醇(强力求偶 素)(17 0 -Estradiol，E2)、雌三醇(Estriol，E3)和孕酮(progesterone，PROG)以及人工 合成的用于口服避孕药物的17 a-乙炔基雌二醇(na-ethynylestradoil，EE2)，研究羟 基酮基同步衍生化方法，使之适用于痕量类固醇类环境内分泌干扰物的检测要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对目前类固醇类环境内分泌干扰物羟基酮基同步衍生化中 存在的不足，提出一种衍生化新方法。该方法具有实验操作简便、省时、衍生化效果好的优点o本专利技术类固醇类环境内分泌干扰物羟基酮基同步衍生化方法，其特征在于包括如 下步骤(1)在酮基同步衍生化步骤中，将固体状类固醇类环境内分泌干扰物雌酮、17 3 雌二醇、17 a -乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮以及内标5 a -雄烷分别溶于甲醇中，振荡60s， 配成浓度为1 P g/y L标准储备液，密封后置于-20 -40°C保存；(2)根据需要，用甲醇以及所说的标准储备液配成含有浓度为5pg/L long/的雌 酮、17 0 -雌二醇、17 a -乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮并含有浓度为100pg/ u L内标的标准 混合溶液；(3)取100yL步骤⑵所制备的标准混合溶液于1.5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入 氮吹仪，通入高纯氮气缓慢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种类固醇类环境内分泌干扰物羟基酮基同步衍生化方法，其特征在于包括如下步骤：　　（１）在羟基酮基同步衍生化步骤中，将固体状类固醇类环境内分泌干扰物雌酮、１７β雌二醇、１７α－乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮以及内标５α－雄烷分别溶于甲醇中，振荡６０ｓ，配成浓度为１μｇ／μＬ标准储备液，密封后置于－２０～－４０℃保存；　　（２）根据需要，用甲醇以及步骤（１）所制备的标准储备液配成含有浓度为５ｐｇ／Ｌ～１０ｎｇ／Ｌ的雌酮、１７β－雌二醇、１７α－乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮并含有浓度为１００ｐｇ／μＬ内标的标准混合溶液；　　（３）取１００μＬ步骤（２）所制备的标准混合溶液于１．５ｍＬ色谱瓶中，将色谱瓶放入氮吹仪，通入高纯氮气缓慢吹干；　　（４）加入以Ｎ－甲基－Ｎ－三甲基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷与二硫赤藓糖醇配成的、其比例为１０００μＬ∶５ｍｇ～１０μＬ∶５ｍｇ的衍生化试剂，振荡混合３０ｓ后，在２０～６０℃条件下反应５～１０ｍｉｎ，以得到雌酮羟基酮基衍生化产物、１７β－雌二醇双羟基衍生化产物、１７α－乙炔基雌二醇双羟基衍生化产物、雌三醇三羟基衍生化产物、孕酮双酮基衍生化产物；　　（５）将反应后的样品取出冷却至室温，振荡混合３０ｓ后，取１μＬ注入气相色谱－质谱联用仪分析。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘学军，方锴，黄斌，刘晶靓，王宇，高建培，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]