【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物，尤其是涉及一种质粒载体对、低免疫原性细胞及其应用。
技术介绍
1、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)是参与免疫排斥主要抗原之一，人的mhc就称人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，hla)，hlai类和ii类基因所表达的抗原位于细胞膜上，为mhc-i(a、b、c位点编码)和mhc-ii(d区编码)。hla-i类分子负责将抗原肽呈递给cd8+t细胞，被激活的cd8+t细胞可以攻击异己细胞，介导免疫排斥反应。
2、人类白细胞抗原-g(human leukocyte antigen-g，hla-g)是位于人第6号染色体短臂上的一群紧密连锁基因群，属于人类一种非经典的mhc i类分子，选择性高表达于侵入子宫蜕膜的绒毛外滋养细胞。妊娠被认为是成功的同种异体移植，很多妊娠相关疾病与滋养细胞异常增殖、浸润、胎盘形成不良有关。与经典的hlai类分子相比，hla-g具有多态性水平低、体内分布局限于特定组织、可形成4种膜结合型和两种可溶型hla-g异构体的特点。已有研究发现hla-g是一种免疫耐受分子，过表达hla-g能够增强细胞的免疫耐受。
3、细胞疗法具有治愈多种难治性疾病的潜力，目前是临床和临床前研究中最受关注的治疗方式之一。目前上市的细胞药物的大多数是自体细胞制品，但在细胞药物的普及中，认为异体细胞的使用必不可少，同种异体移植细胞或组织带来的免疫排斥或免疫抑制问题严重限制了细胞疗法的临床应用，因此需要解决同
4、由β2-微球蛋白(beta 2-microglobulin，b2m)基因编码的b2m蛋白构成hla-i类分子的轻链。b2m基因的敲除可以导致hla-i类分子功能丧失，显著降低细胞对cd8+t细胞的免疫原性。
5、ciita基因是mhc ii类转录激活子，能启动mhcii基因复合体的表达。沉默ciita基因，能特异性导致其下游mhcii基因的沉默，降低细胞之间的免疫排斥反应。
6、cn201880006714.x公开了一种免疫改造的多能细胞，使用crispr/cas9(talen、锌指核酸酶、rna干扰)技术敲除了b2m基因和ciita，通过慢病毒过表达cd47，从而使ipsc不表达hla-i和mhcii/hla-ii，降低同种异体移植ipsc的免疫排斥反应。
7、cn201580072367.7公开了一种产生用于移植的被修饰干细胞的方法，被修饰干细胞具有降低的免疫原性，其中ciita基因破坏的方法为：使用talens在修饰的细胞中敲除ciita，其中ciita的talen是针对外显子2和外显子3设计。
8、cn202180037981.5公开了通过b2m基因或ciita基因的缺失、或者pd-l1基因或hla-g基因或hla-e基因的敲入而得到的低免疫原性细胞。
9、综上，目前降低细胞免疫排斥反应的技术主要有：(1)通过慢病毒表达shrna来敲除/低细胞b2m/ciita表达；(2)通过定点插入基因编辑技术(talen、crispr/cas9等)表达shrna来敲除/降低细胞b2m/ciita表达；(3)通过慢病毒过表达hla-g及其类似基因；(4)通过定点插入基因编辑技术(talen，crispr cas9等)过表达hla-g及其类似基因。
10、但是现有技术降低免疫排斥的方式永久性地改变了细胞的免疫原性，带来了成瘤性的风险。如何进一步提高细胞的低免疫原性，并保证低免疫原性的可调控性和安全性，则是现有技术需要解决的关键技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术基于嵌合notch受体多肽结构的基本原理，提供了一种质粒载体对、低免疫原性细胞及其应用。本专利技术通过第一质粒载体和第二质粒载体构成的质粒载体对，共同调控免疫原相关基因的表达，能够实现增强细胞免疫耐受性和降低免疫原性的功能，从而可实现降低或抑制免疫排斥反应。
2、本专利技术提供的技术方案如下：
3、在一个方面，本专利技术提供了一种质粒载体对，其包括第一质粒载体和第二质粒载体，所述第一质粒载体包含notch调控区、编码胞外段和胞内段的核酸，所述胞外段含有编码人类白细胞抗原-g(hla-g)的核酸，所述胞内段含有转录激活因子；所述第二质粒载体包含与所述第一质粒载体中的胞内段特异性结合的应答元件以及编码调控免疫原性的核酸；
4、在本专利技术中，所述notch调控区也可称为notch调节区，是指notch核心(nldomain)，含有含有lin 12-notch重复单元、s2蛋白水解切割位点和含s3蛋白水解切割位点的跨膜结构。本专利技术构建了一对载体对，所述第一质粒载体是胞外段vb表达hlag基因，使宿主细胞(如多能干细胞)在胞外表达游离的hlag蛋白，hlag蛋白在胞外能够抑制免疫反应。当第一质粒载体上的转录激活因子与第二质粒载体上的应答元件结合后，则启动第二质粒载体调控免疫原性基因的表达，进一步降低细胞的免疫原性。
5、在一个实施方案中，所述notch调控区的核苷酸序列如seq id no:1所示；
6、进一步地，所述转录激活因子为gal4vp64，所述应答元件为gal4uas；所述gal4vp64具有seq id no:2所示的核酸序列；
7、进一步地，所述编码人类白细胞抗原-g的核酸的核苷酸序列如seq id no:3所示。
8、在本专利技术的一个实施方案中，第一质粒载体的胞内段中含有转录激活因子，第二质粒载体体含有与所述第一载体中的胞内段的转录激活因子特异性识别和结合的核酸分子(应答元件)；所述转录激活因子包括但不限于gal4vp64；所述应答元件包括但不限于gal4uas。其中，gal4uas是gal4vp64的结合位点，未接触免疫细胞时，第一质粒载体上的gal4vp64不会被水解切割，不会触发第二质粒载体中调控免疫原性基因的表达；当接触免疫细胞时，会引发第一载体上的gal4vp64被水解切割，游离的gal4vp64与第二载体上的gal4uas特异性结合，启动调控免疫原性基因的表达。
9、进一步地，第一质粒载体和第二质粒载体还任选地包括信号肽、启动子、标签和报道基因(如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因)等的一种或多种。
10、在一个实施方案中，所述调控免疫原性的核酸包括调控免疫耐受分子表达的核酸、调控mhc-i类分子表达的核酸或调控mhc-ii类分子表达的核酸；
11、所述免疫耐受分子包括分泌型人类白细胞抗原-g(shlag)；优选地，所述免疫耐受分子为分泌型人类白细胞抗原-g(shlag)，其核苷酸序列如seq id no:4所示；
12、所述调控mhc-i类分子表达的核酸为抑制mhc-i类分子表达的核酸；优选地，所述mhc-i类分子包括b2m、hla-a、hla-b或hla-c中的一种或多种；
13、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种质粒载体对，其包括第一质粒载体和第二质粒载体，其特征在于，所述第一质粒载体包含Notch调控区、编码胞外段和胞内段的核酸，所述胞外段含有编码人类白细胞抗原-G的核酸，所述胞内段含有转录激活因子；所述第二质粒载体包含与所述第一质粒载体中的胞内段特异性结合的应答元件以及编码调控免疫原性的核酸；
2.根据权利要求1所述的质粒载体对，其特征在于，所述调控免疫原性的核酸包括调控免疫耐受分子表达的核酸、调控MHC-I类分子表达的核酸或调控MHC-II类分子表达的核酸；
3.根据权利要求2所述的质粒载体对，其特征在于，所述调控MHC-I类分子表达的核酸为抑制B2M基因表达的核酸，包含第一U6启动子和shB2M结构；
4.根据权利要求2所述的质粒载体对，其特征在于，所述调控MHC-II类分子表达的核酸为抑制CIITA基因表达的核酸，包含第二U6启动子和shCIITA结构；
5.低免疫原性细胞，其特征在于，所述细胞转染有权利要求1-4中任一项所述的质粒载体对，所述细胞包括免疫细胞、胚胎干细胞、多能干细胞中的一种或多种，或者由多能干细胞或胚胎干
6.根据权利要求5所述的低免疫原性细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、DC细胞、造血干细胞中的一种或多种；
7.根据权利要求5所述的低免疫原性细胞，其特征在于，所述第一质粒载体在所述细胞中瞬时表达，所述第二质粒载体在所述细胞中稳定表达，所述细胞获得50-70天的低免疫原性；
8.一种制备权利要求5-7任一项所述的低免疫原性细胞的方法，其特征在于，包括：包括将权利要求1-4所述的质粒载体对转染至所述细胞中，所述转染的方式包括慢病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法中任一种；
9.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-4中任一项所述的质粒载体对和权利要求5-7中任一项所述的低免疫原性细胞；优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
10.权利要求1-4中任一项所述的质粒载体对和权利要求5-7中任一项所述的低免疫原性细胞的应用，其特征在于，所述应用包括以下中的至少一种：
...【技术特征摘要】
1.一种质粒载体对，其包括第一质粒载体和第二质粒载体，其特征在于，所述第一质粒载体包含notch调控区、编码胞外段和胞内段的核酸，所述胞外段含有编码人类白细胞抗原-g的核酸，所述胞内段含有转录激活因子；所述第二质粒载体包含与所述第一质粒载体中的胞内段特异性结合的应答元件以及编码调控免疫原性的核酸；
2.根据权利要求1所述的质粒载体对，其特征在于，所述调控免疫原性的核酸包括调控免疫耐受分子表达的核酸、调控mhc-i类分子表达的核酸或调控mhc-ii类分子表达的核酸；
3.根据权利要求2所述的质粒载体对，其特征在于，所述调控mhc-i类分子表达的核酸为抑制b2m基因表达的核酸，包含第一u6启动子和shb2m结构；
4.根据权利要求2所述的质粒载体对，其特征在于，所述调控mhc-ii类分子表达的核酸为抑制ciita基因表达的核酸，包含第二u6启动子和shciita结构；
5.低免疫原性细胞，其特征在于，所述细胞转染有权利要求1-4中任一项所述的质粒载体对，所述细胞包括免疫细胞、胚胎干细胞、多能干细胞中的一种或多种，...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴理达，顾雨春，高嘉悦，王晨旭，李冬梅，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。