【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵工程，具体涉及一种利用农作物秸秆固定化微生物菌种发酵生产丁二酸的方法。
技术介绍
1、丁二酸，又称琥珀酸，是一种重要的化工原料及中间体。作为一种优秀的c4平台化合物，在食品、化学、医药工业等领域有着广泛的应用，可以取代很多基于苯和石化中间产物的商品，如可用于合成聚丁二酸丁二醇酯(poly butylene succinate,pbs)、聚丁二酸己二醇酯(poly hexylene succinate,phs)等新型生物可降解原料，市场潜在需求量非常大，应用前景十分广阔。
2、目前，丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法。化学合成法，由于环境污染大、生产成本高、操作条件复杂、石化资源日益枯竭等原因，化学合成的生产方法受到严重的限制；而利用微生物发酵法生产丁二酸，具有污染小、成本低、环境友好等优势，且在发酵过程中可以固定利用气体co2，在一定程度上可以减缓温室效应。因此，开发高效的微生物发酵生产丁二酸的方法具有十分重要的环境与经济效益。
3、微生物发酵法生产丁二酸，由于具有发酵产物抑制菌体生长、菌种耐高渗能力差、后分离工艺困难等因素，往往会限制微生物的发酵产酸水平。如何解决产物的反馈抑制、保持高产菌种的活性是当前的研究难题，细胞固定化是解决该问题的一种重要手段。
4、cn107164416a、cn103436561b、cn103642854b等公开了纺布、棉纤维等载体吸附菌液的固定化方法，固定化的菌种分别是产琥珀酸放线杆菌和谷氨酸棒杆菌，产酸和转化率均不是很高，可
5、然而，利用包埋或者吸附方法制备的固定化细胞经常存在固定化细胞活性弱、包埋细胞渗漏或者吸附菌体不牢固容易脱落、传质效果差等缺点，因此，开发一种较好的细胞固定化方法尤为关键，尤其对传质要求较高的丁二酸发酵应用具有必要的指导意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种利用农作物秸秆固定化微生物菌种发酵生产丁二酸的方法，可以保持较好的菌种活力、提升丁二酸发酵产量，解决产物抑制以及固定化菌体泄漏等问题。
2、为达到上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种利用农作物秸秆固定化微生物菌种发酵生产丁二酸的方法，包括如下步骤：
4、1)秸秆的预处理与变性：将农作物秸秆预处理后加入有机酸进行变性处理；
5、2)秸秆吸附菌体：在变性处理好的秸秆中加入生物黏合剂，然后加入培养好的微生物菌种菌悬液和无菌水，在摇床上培养，让菌体与秸秆充分吸附连接；
6、3)固定化菌种细胞微球的制备：先称取载体和致孔剂并溶解灭菌，冷却后加入步骤2)吸附菌液后的秸秆和引发剂，混匀后进行固定化，再滴加到盛有硫酸盐溶液的容器中，待交联成球后，将硫酸盐溶液滤干，优选最后再加入磷酸盐溶液继续搅拌1～10小时，以促进进一步交联，保证载体材料能够交联充分，固定化微球更牢固；优选地，所述载体选自聚乙烯醇(pva)、海藻酸钠、氯化钙、聚乙二醇、聚乙烯亚胺中的任一种，优选为聚乙烯醇；所述致孔剂选自聚二烯吡咯烷酮；所述引发剂选自聚二烯丙基甲基氯化铵、过硫酸铵、过硫酸钾、偶氮二异丁酸二甲酯中的任一种，优选为聚二烯丙基甲基氯化铵；
7、4)固定化微球的改性：将步骤3)中的固定化微球滤干后，用无菌水清洗，再加入助流剂、无水乙醇及表面活性剂，超声分散后过滤、干燥得到表面改性的固定化菌种细胞微球；
8、5)固定化发酵：将步骤4)表面改性的固定化菌种细胞微球输入到含有无菌液体发酵培养基的发酵罐中，进行固定化发酵，发酵过程通二氧化碳气体用中和剂控制ph为5～8，不断搅拌，间歇补糖，发酵得到丁二酸，发酵结束后去掉发酵液分离得到固定化微球循环回用。
9、在一个具体的实施方案中，步骤1)中所述的农作物秸秆选自玉米、黄瓜、芝麻、番茄、小麦、大豆的秸秆中的至少任一种，优选为黄瓜和/或小麦的秸秆，更优选为小麦秸秆；
10、优选地，所述有机酸选自丁二酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸、甲酸中的任一种，优选为丁二酸；
11、优选地，步骤1)为：将农作物秸秆粉碎后过1～10mm筛，按质量比称取预处理后的秸秆1～10％，丁二酸0.1～10％和磷酸二氢钠0.1～1％置于容器中，加入余量的去离子水，超声震荡1～60min，50～130℃高压锅煮沸0.1～10小时，待充分溶解后，再放入到烘箱中105～180℃条件下加热1～10h，冷却后，用去离子水浸洗，抽滤并冲洗至中性，最后放入烘箱中30～100℃烘干，备用。
12、在一个具体的实施方案中，所述的固定化微生物菌种为大肠杆菌、产琥珀酸放线杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母菌中的任意一种或几种，优选为大肠杆菌；
13、优选地，大肠杆菌菌悬液采用如下方法制备：从平板培养基中挑取一个生长良好的大肠杆菌单菌落接种于20～100ml lb液体培养基中，在30℃～40℃、150～200rpm的恒温摇床中振荡培养6～18h，按体积分数0.1％-5％接种到种子培养基中，同样条件下培养15～20h，使菌种处于对数生长期后期，作为菌悬液备用；
14、更优选地，所述平板培养基为：酵母浸粉1～10g/l、蛋白胨5～20g/l、氯化钠1～20g/l、琼脂5～30g/l；
15、所述lb液体培养基为：酵母浸粉1～10g/l、蛋白胨5～20g/l、氯化钠1～20g/l；
16、所述种子培养基为：葡萄糖1～10g/l、氯化铵1～10g/l、酵母浸粉0.1～5g/l、磷酸氢二钾1～10g/l、七水硫酸镁0.1～10g/l、硫酸亚铁0.1～10g/l、硫酸锰0.1～5g/l、硫酸铜0.1～5g/l。
17、在一个具体的实施方案中，所述的生物黏合剂为可溶性淀粉和酪蛋白，两者的质量比为1：5～1：1，优选为1：1；
18、优选地，步骤2)中变性处理好的秸秆占整个秸秆吸附菌体体系的质量比例为1～10％，优选为1.5～2.5％，更优选为2.5％，生物黏合剂的质量占比为0.1～2％，更优选为0.4％，菌悬液的质量占比为80～90％，余量为无菌水；
19、更优选地，步骤2)为：称取步骤1)变性处理好的秸秆中加入可溶性淀粉、酪蛋白，30～80℃温度下加热溶解，待冷却后加入培养好的微生物菌种菌悬液，再加入适量的无菌水，在摇床上30～40℃、100～200rpm培养2～15h，让菌体与秸秆充分吸附连接。
20、在一个具体的实施方案中，步骤3)为：称取1～10％pva和0.01～10％聚二烯吡咯烷酮100～130℃溶解灭菌，冷却至15～50℃左右时再加入吸附菌液后的秸秆和0.01～10％聚二烯丙基甲基氯化铵，用无菌水补至100％混匀后进行固定化，采用蠕动泵，从10～30cm高处将其缓慢匀速滴加到磁力搅拌器上的盛有1～15％硫酸盐溶液的容器中，待交联成本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用农作物秸秆固定化微生物菌种发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的农作物秸秆选自玉米、黄瓜、芝麻、番茄、小麦、大豆的秸秆中的至少任一种，优选为黄瓜和/或小麦的秸秆，更优选为小麦秸秆；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化微生物菌种为大肠杆菌、产琥珀酸放线杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母菌中的任意一种或几种，优选为大肠杆菌；
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的生物黏合剂为可溶性淀粉和酪蛋白，两者的质量比为1：5～1：1，优选为1：1；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)为：称取1～10％PVA和0.01～10％聚二烯吡咯烷酮100～130℃溶解灭菌，冷却至15～50℃左右时再加入15～30％吸附菌液后的秸秆和0.01～10％聚二烯丙基甲基氯化铵，用无菌水补至100％混匀后进行固定化，采用蠕动泵，从10～30cm高处将其缓慢匀速滴加到磁力搅拌器上的盛有1～15％硫酸盐溶液的容器中，待交联成球1～10个小时后，将硫酸
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中助流剂选自SiO2颗粒、滑石粉、硬脂酸镁中的任一种，优选为SiO2颗粒，更优选为微米级SiO2颗粒；表面活性剂选自聚二甲基硅氧烷、吐温80、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、月桂酰谷氨酸中的任一种，优选为聚二甲基硅氧烷；
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)为：将步骤4)改性好的固定化菌种细胞微球无菌输入到发酵罐中，发酵罐中含有10～30倍固定化微球体积的液体发酵培养基，控制罐内温度30～40℃，固定化发酵过程用中和剂碳酸盐控制pH为5～8，搅拌转速100～1000rpm，发酵期间通二氧化碳气体，0.2～1vvm，罐压维持在0.01～1Mpa，初始葡萄糖10～100g/L，当残糖浓度耗至0～20g/L时，间歇补糖至5～100g/L，发酵40～100h，发酵结束后，去掉发酵液分离得到固定化微球循环回用。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为：葡萄糖10～80g/L、玉米浆5～20g/L、氯化铵1～10g/L、磷酸氢二钾0.1～10g/L、磷酸二氢钾0.1～10g/L、七水硫酸镁0.1～5g/L、硫酸亚铁0.01～5g/L、硫酸锰0.01～1g/L、氯化锌0.1～1g/L、硫酸铜0.1～5g/L，溶剂为水，pH 6.8～7.2。
9.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，固定化发酵过程中所用的中和剂选自碳酸镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸铵中的任一种或者几种，优选为碳酸铵。
10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，发酵结束后，去掉发酵液，然后加入新鲜的无菌培养基，重复步骤5)的单批次固定化发酵生产丁二酸的步骤，如此循环，即可利用固定化菌种细胞微球实现丁二酸的多批次固定化发酵生产。
...【技术特征摘要】
1.一种利用农作物秸秆固定化微生物菌种发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的农作物秸秆选自玉米、黄瓜、芝麻、番茄、小麦、大豆的秸秆中的至少任一种，优选为黄瓜和/或小麦的秸秆，更优选为小麦秸秆；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化微生物菌种为大肠杆菌、产琥珀酸放线杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母菌中的任意一种或几种，优选为大肠杆菌；
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的生物黏合剂为可溶性淀粉和酪蛋白，两者的质量比为1：5～1：1，优选为1：1；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)为：称取1～10％pva和0.01～10％聚二烯吡咯烷酮100～130℃溶解灭菌，冷却至15～50℃左右时再加入15～30％吸附菌液后的秸秆和0.01～10％聚二烯丙基甲基氯化铵，用无菌水补至100％混匀后进行固定化，采用蠕动泵，从10～30cm高处将其缓慢匀速滴加到磁力搅拌器上的盛有1～15％硫酸盐溶液的容器中，待交联成球1～10个小时后，将硫酸盐溶液滤干，最后加入1～10％磷酸盐溶液继续搅拌1～10小时以上进一步交联，停止搅拌；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中助流剂选自sio2颗粒、滑石粉、硬脂酸镁中的任一种，优选为sio2颗粒，更优选为微米级sio2颗粒；表面活性剂选自聚二甲基硅氧烷、吐温80、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、月桂酰谷氨...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨尚彤，王竞辉，吴计划，刘胜先，王嘉，刘开开，夏顺炜，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。