色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法技术

一种色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法，采用ＢＩＯ－３Ｘ填料的凝胶净化柱；淋洗剂为乙酸乙酯∶环己烷＝１∶１，收集７．４８～１２．６０ｍｉｎ的馏分；净化后在二氯甲烷和甲醇的溶剂中低温皂化，使虾青素酯完全转化为游离虾青素；采用ＹＭＣ－Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ?Ｃ３０色谱柱；以甲醇、叔丁基甲基醚和１％的磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ，检测器为紫外检测器，检测波长为４７４ｎｍ；确定虾青素的三种同分异构体，并采用三个峰面积的加和定量。本发明专利技术凝胶色谱柱使南极磷虾油中的脂肪和虾青素得到较好分离，采用Ｃ３０－反相高效液相色谱法可以准确测定虾青素的含量，客观真实地评价南极磷虾油质量的优劣。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种色谱检测的方法，具体涉及一种用凝胶渗透色谱净化-高效液相 ，即一种采用凝胶渗透色谱净化，C30-反相高 效液相色谱分离，紫外检测器测定南极磷虾油中虾青素含量的方法。
技术介绍
凝胶渗透色谱作为一种样品的净化手段之一，在国外应用的已较普遍，在我国， GPC在农药残留前处理分离、净化方面的应用将越来越普遍，尤其是在富含脂肪、色素等大 分子的样品分离净化方面，具有明显的净化效果。高效液相色谱法应用范围广，对被测物质活性影响小，几乎可以测定食品中所有 的非挥发性物质，在化学分析中发挥着重要作用。色谱柱是色谱仪起分离作用的关键部件， 其核心是优质的色谱填料。进行特定的色谱分离工作，首先要有性能良好的色谱柱，选择在 确定的分离条件下分离效率高和分析时间短的色谱柱。虾青素(Astaxanthin，3，3'- 二羟基 _4，4' - 二酮基-β，β'-胡萝卜素)，分 子式为C4tlH52O4，相对分子质量为596. 86，是一种类胡萝卜素衍生物，具有很强的抑制肿瘤发 生和生长、抑制多元不饱和脂肪酸的氧化、抵御紫外线的作用；具有代维生素A活性、增强 人体免疫功能、改善视力、色素形成和神经连通以及改善生育的作用，同时还具有清除二氧 化氮、硫化物、二硫化物和降低脂质过氧化作用，因此在化妆品、保健品和医药工业中具有 广泛的应用前景。南极磷虾中含有丰富的ω-3不饱和脂肪酸、磷脂和虾青素等活性物质。从南极磷 虾中提取的虾油中的虾青素含量与加工工艺密切相关，是评价南极磷虾油质量优劣的重要 指标。而南极磷虾油中的虾青素主要以虾青素酯的形式存在，游离虾青素占的比例较少，由 于虾青素酯和游离虾青素的同分异构体种类较多，难以同时对各组分进行分离测定。而虾 青素酯经皂化或酶解后可以完全转化为游离的虾青素，游离的虾青素主要有三种同分异构 体全反式虾青素，9-顺-虾青素，13-顺-虾青素，通过对游离虾青素的三种同分异构体进 行分离测定，可以用于南极磷虾油中虾青素含量的测定。目前，能否准确测定南极磷虾油中 的虾青素含量是亟待解决的现实问题。虾青素的分析方法主要为分光光度法和高效液相色谱法，其中液相色谱法更加 准确、有效。但是，液相色谱法测定虾青素主要是以全反式虾青素的定量为主，由于只有 全反式虾青素的制备较容易，可是结果不够准确。Jian-Ping Yuan等(香港大学，Food Chemistry, 68 (2008) :443_448)采用 Waters Symmetry C18 色谱柱分离分析了雨生红球藻 中的虾青素，并采用全反相半制备柱分离纯化了虾青素的同分异构体，但没有定量方法。目 前，还没有关于南极磷虾油中虾青素测定方法的文献。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种用凝胶渗透色谱净化_高效液相色谱法测定南极3磷虾油中虾青素含量的方法，凝胶色谱柱使南极磷虾油中的脂肪和虾青素得到较好分离， 采用C30-反相高效液相色谱法可以客观真实地反映其含量。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为凝胶渗透色谱净化_高效液相，包括 以下步骤a、采用BI0-3X填料的凝胶净化柱(定量线圈5mL，玻璃柱25mm*600mm)对南极 磷虾油进行净化；b、磷虾油的淋洗剂为乙酸乙酯和环己烷，乙酸乙酯环己烷=1 1，收集7. 48 12. 60min的馏分；C、磷虾油经净化后旋转蒸干，用二氯甲烷甲醇(V V, 25 75，含1 % BHT)溶 解后，定量加入0.2M NaOH甲醇溶液，充氮后在5°C冰箱中反应过夜(12h以上)，使虾青素 酯完全转化为游离虾青素；d、采用YMC-Carotenoid C30色谱柱(250mmX4. 6mmX5ym)对虾青素进行分离测 定；e、以甲醇(A)、叔丁基甲基醚(B)和的磷酸水溶液(C)为流动相，梯度洗脱程 序为 Omin 15min，81% 66% A, 15% 30% B,4% C ； 15min 23min，66% 16% A, 30% 80% B，4% C ；23min 27min，16% 81 % A，80% 15% B，4% C ；27min 30min， 81% A, 15% B,4% C ；f、流动相的流速为1. OmL/min，检测器为紫外检测器，检测波长为474nm，进样量 为20 μ L，柱温为30°C ；g、确定虾青素的三种同分异构体，即全反式虾青素，9-顺-虾青素，13-顺-虾青 素，并采用三个峰面积的加和定量。与现有技术相比，本专利技术具有的优点和效果如下1、本专利技术的凝胶色谱柱能使南极磷虾油中的脂肪和虾青素得到较好分离，采用 C30-反相高效液相色谱法可以客观真实地反映虾青素的含量，方法简单、灵敏、准确、重现 性好。2、线性试验及检测限试验结果表明，在一定浓度范围内，峰强度与质量浓度的线 性关系良好(r > 0. 99)；方法的定量限为20mg/kg。3、方法的加标回收率范围为95. 20Z0 106. 7%，相对标准偏差为3. 3% 13. 5%。 附图说明图1 是虾青素的光谱图。图2 =NaOH甲醇溶液添加体积对虾青素皂化效率的影响。图3 不同皂化时间对虾青素皂化效率的影响。图4 南极磷虾油样品皂化前后色谱图，其中a为皂化前，b为皂化后。图5 为虾青素标准溶液的选择离子图(1 μ g/mL)(质谱定性)。图6 虾青素标准溶液皂化后色谱图。具体实施例方式本专利技术为一种用凝胶渗透色谱净化_高效液相色谱法测定南极磷虾油中虾青素 含量的方法，具体出峰顺序为全反式虾青素，9-顺_虾青素，13-顺_虾青素。虾青素酯经 皂化后可以完全转化为游离的虾青素，采用C30-反相高效液相色谱法可以客观真实地反 映出游离虾青素的含量。通过考察不同的试验参数进行了大量的反复比较试验，最终选用了最佳的净化条 件、皂化条件和色谱条件。下面以具体实施例并结合附图，进一步详细叙述本专利技术测定南极磷虾油中虾青素 含量的技术方法。一凝胶渗透色谱净化条件的建立及皂化条件的考察仪器=Accuprerp MPS 自动凝胶色谱系统(GPC，美国J2 Scientific公司)，美国 Agilent 1100高效液相色谱仪，配紫外检测器。试剂甲醇、二氯甲烷和叔丁基甲基醚均为色谱纯，2，6_ 二叔丁基对甲酚(BHT)为化学纯。采用BI0-3X填料的凝胶净化柱(定量线圈5mL，玻璃柱25mm*600mm)；GPC淋洗曲线样品运行前，须对自动凝胶色谱系统的淋洗条件进行选择。采用推 荐流速5. OmL/min洗脱，淋洗剂为乙酸乙酯和环己烷，乙酸乙酯环己烷=1 1，以紫外检 测器检测虾青素标液的流出时间以确定组分收集。由紫外吸收图可见(见图1)，虾青素的 流出时间在7. 48-12. 60min之间。在溶剂洗脱条件下，以一定浓度标液进样，重复5次，虾 青素的回收率分别为95. 3%、96. 2%、95. 8%、97. 1%、95. 1%，均大于95%，以此确定了 本方法的洗脱曲线。皂化条件考察对不同的皂化溶剂、不同碱浓度和皂化时间对虾青素酯的皂化效 率的影响进行了考察。考察了丙酮(含BHT)、二氯甲烷(含BHT)、二氯甲烷甲醇(V V, 25 75，含BHT)、乙腈甲醇(V V，75 25，含BHT)作本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：ａ、采用定量线圈：５ｍＬ、玻璃柱：２５ｍｍ＊６００ｍｍ、ＢＩＯ－３Ｘ填料的凝胶净化柱对南极磷虾油进行净化；ｂ、磷虾油的淋洗剂为乙酸乙酯和环己烷，乙酸乙酯∶环己烷＝１∶１，收集７．４８～１２．６０ｍｉｎ的馏分；ｃ、磷虾油经净化后在含１％ＢＨＴ、体积比２５∶７５的二氯甲烷∶甲醇的溶剂中皂化，使虾青素酯转化为游离虾青素；ｄ、采用２５０ｍｍ×４．６ｍｍ×５μｍ规格的ＹＭＣ－ＣａｒｏｔｅｎｏｉｄＣ３０色谱柱对虾青素进行分离测定；ｅ、以Ａ：甲醇、Ｂ：叔丁基甲基醚和Ｃ：１％的磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱程序为０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ，８１％～６６％Ａ，１５％～３０％Ｂ，４％Ｃ；１５ｍｉｎ～２３ｍｉｎ，６６％～１６％Ａ，３０％～８０％Ｂ，４％Ｃ；２３ｍｉｎ～２７ｍｉｎ，１６％～８１％Ａ，８０％～１５％Ｂ，４％Ｃ；２７ｍｉｎ～３０ｍｉｎ，８１％Ａ，１５％Ｂ，４％Ｃ；ｆ、流动相的流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ，检测器为紫外检测器，检测波长为４７４ｎｍ，进样量为２０μＬ，柱温为３０℃；ｇ、确定虾青素的三种同分异构体，即：全反式虾青素，９－顺－虾青素，１３－顺－虾青素，并采用三个峰面积的加和定量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙伟红，冷凯良，邢丽红，苗钧魁，肖荣辉，许洋，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]