【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。
技术介绍
1、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，gba，ec 3.2.1.21）催化末端非还原性β-d-葡萄糖基残基的水解并释放β-d-葡萄糖，该反应无需任何辅酶、辅因子或金属离子的参与。β-葡萄糖苷酶可以水解各种糖苷、低聚糖和纤维素，皆为由β-1,4-连接的葡萄糖残基组成的聚合物。β-葡萄糖苷酶广泛存在于各种原核生物和真核生物中，对于许多生物体的代谢过程至关重要。该反应在体内的功能是在生物质水解过程中去除二糖纤维二糖中的残留物以产生葡萄糖。由于β-葡萄糖苷酶具有较为宽泛的底物谱，其在工程上有多种应用，包括催化水解纤维素和淀粉；去除果蔬汁和葡萄酒的苦味成分；预处理棉花，提高紧密纺纱质量；还可以催化环烯醚萜苷生产环烯醚萜。
2、环烯醚萜（iridoid）是一类天然存在的类固醇衍生物。主要的环烯醚萜类化合物包括：州烯醚类、吲哚烯类、孚喹啉类、并苯啉类、睾酮类、醇醚类、黄酮羧基醚类、丁香醚类、会吕烯类、烯醇类、亚脲类、麝香烯类、马奇尼酮类、異戊烯醚类、木质素类和茄草素、种蒿醚等其他环烯醚类。它们在生物体内主要通过调节免疫、抗癌、抗炎等途径发挥功效。主要包括：免疫调节作用、抗创伤与促愈合作用、抗炎作用、抗肿瘤作用、免疫原性与过敏反应、神经保护作用、卵巢功能调节作用和骨质形成作用。环烯醚萜往往可以通过水解带糖基的环烯醚萜糖苷获得，催化该步反应的酶则是β-葡萄糖苷酶。这也是目前工业上生产环烯醚萜的方法。
3、工业上β-葡萄糖苷酶的天然来源主要
4、尽管目前已经有专利技术专利提到过β-葡萄糖苷酶的其制备方法与应用，但这些方法在应对提升京尼平品质，阻止其变蓝方面没有借鉴意义。它们的局限性在于：首先，未以京尼平苷为底物进行酶催化反应，它们报道的β-葡萄糖苷酶以人参皂苷等其他物质为底物；其次，未能就相应β-葡萄糖苷酶进行分子改造，仅仅是利用大肠杆菌进行了可溶性表达；第三，大肠杆菌体内对酶的表达是在体内，对酶进一步利用需要经过细胞破碎步骤，步骤繁琐、成本高，且大肠杆菌在生长过程中会产生内毒素，不利于食品、医药相关产品的生产。
技术实现思路
1、针对以上现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种能够高效转化京尼平苷为京尼平，且蛋白质表面不带有精氨酸或赖氨酸残基的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。
2、一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶突变体（gbam2）是在如seq id no.1所示氨基酸序列的第2到第21位氨基酸残基的敲除的基础上，将第31、78、100、130、169、191、265、314、330、360、381、441、504上的赖氨酸替换为组氨酸，以及将第41、99、176、223、259、284、296、386、454、509位上的精氨酸也替换为组氨酸后获得，改造后的β-葡萄糖苷酶突变体（gbam2）的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3、本专利技术还提供一种编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因，其dna碱基序列如seqid no. 3所示。
4、本专利技术还提供一种携带所述基因的重组载体或重组细胞。
5、本专利技术还提供一种β-葡萄糖苷酶突变体的应用，步骤如下：
6、（1）分泌表达载体构建：将α-factor信号肽基因和his标签基因连接到β-葡萄糖苷酶突变体基因上，并克隆到带有的pyes2质粒上，构建重组质粒pyes2-af-gbam2；
7、（2）重组菌主构建：将重组质粒利用电转化方法转入酿酒酵母 saccharomyces cerevisiaewhu2d(leu-,trp-,ade-, ura-) 中，筛选转化成功的转化子，即建立表达异源蛋白的酿酒酵母重组子；
8、（3）菌主培养和蛋白质异源表达：在30oc下，挑选单菌落在含有2%葡萄糖的选择培养基中经二次放大后培养到od600达到0.4-0.6，离心收集菌体，用不含葡萄糖的2%半乳糖培养基重悬，诱导8小时；
9、（4）蛋白质收集纯化：表达结束后收集菌液离心，收集上清液进行胞外异源表达酶性质表征。向上清液中加入20mm咪唑，将上清液投入平衡后的镍柱当中，随后使用40mm咪唑洗涤柱子，最后用250mm咪唑洗脱酶突变子；
10、（5）酶活测定：突变子gbam2经镍柱纯化后，在45℃，ph9.0的条件下测定其比活力（u/mg），km，和kcat；
11、（6）判断：对比突变型gbam2其与野生型gba在催化京尼平苷产生京尼平后反应液变蓝的程度，和它们的比活力，（u/mg），km，和kcat，以及热稳定性和ph值耐受性。
12、上述酿酒酵母异源表达gba的方法中：步骤（2）所述转化优选采用电转化法。
13、上述酿酒酵母异源表达gba的方法中：步骤（2）所述筛选得到转化子的方法优选为：在含有20mg/ml葡萄糖的培养基中加入200μg/ml 抗生素g418的合成营养缺陷型培养基（sc-ura）来筛选带抗性基因的重组子。
14、本专利技术的有益效果在于：改造后的β-葡萄糖苷酶突变体gbam2的酶学特征为：与野生型相比，gbam2在45℃，ph9.0下的比活力（u/mg）由97.8升高到115.3，km（mm）由42.6降低到40.5，kcatx103（min-1）由10.5变为11.6，最适反应温度由55℃提高到了60-65℃。50℃下的半衰期提高了30倍，达到了350min；催化京尼本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，β-葡萄糖苷酶突变体GBAm2是在如SEQ IDNO. 1所示氨基酸序列的第2到第21位氨基酸残基的敲除的基础上，将第31、78、100、130、169、191、265、314、330、360、381、441、504上的赖氨酸替换为组氨酸，以及将第41、99、176、223、259、284、296、386、454、509位上的精氨酸也替换为组氨酸后获得，β-葡萄糖苷酶突变体GBAm2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，β-葡萄糖苷酶突变体GBAm2的DNA序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.一种如权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶突变体的应用，其特征在于，包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，β-葡萄糖苷酶突变体gbam2是在如seq idno. 1所示氨基酸序列的第2到第21位氨基酸残基的敲除的基础上，将第31、78、100、130、169、191、265、314、330、360、381、441、504上的赖氨酸替换为组氨酸，以及将第41、99、176、223、259、284、296、386、454...
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