【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种脂肪酶突变体及其应用，属于生物。
技术介绍
1、脂肪酶属羧基酯水解酶，全称三酰甘油酰基水解酶，是催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油单酯或二酯一类酶的总称。脂肪酶在油水界面上其催化活力最大，其具有水溶性酶，可作用于非水溶性底物，使反应在两个彼此分离的完全不同的相界面上进行的催化特性。作为重要的工业酶制剂，脂肪酶广泛存在于动、植物和微生物中。由于微生物易培养、生长周期短、表达量高及作用范围广等优势，因此，微生物来源的脂肪酶得到大量研究。广泛应用于医药、食品、皮革、饲料添加及油脂加工等领域。
2、此外，以脂肪酶作为催化剂，酶法合成聚合物及生物材料得到大量研究。如xinranl等人(copper phthalocyanine improving nonaqueous catalysis of pseudomonascepacia lipase for ester synthesis.applied biochemistry and biotechnology(2023))以固定化脂肪酶novozym435为催化剂，在甲苯中催化2,5-呋喃二甲酸二甲酯与正丁醇转酯化反应制备2,5-呋喃二甲酸正丁酯(dbf)。tomasz s等人(highenantioselective novozym 435-catalyzed esterification of(r,s)-flurbiprofenmonitored with a chiral stationary phase.applied biochemistry
3、然而，大部分脂肪酶属于中温脂肪酶，其最适温度低于等于45℃，耐热性能较差。来源于微生物的酶大多与其宿主具有相似的适应性，因此，研究人员从嗜热菌入手以纯化出高热稳定性的脂肪酶。bakir z b等(purification and characterization of analkali-thermostable lipase from thermophilic anoxybacillus flavithermus hbb134.journal of microbiology and biotechnology(2016))从嗜热菌anoxybacillusflavithermus hbb 134的发酵产物中分离纯化得到最适反应温度为50℃的脂肪酶。sun qq等(heterologous production of an acidic thermostable lipase with broad-rangeph activity from thermophilic fungus neosartorya fischeri p1.journal ofbioscience and bioengineering(2016))分离自嗜热真菌neosartorya fischeri p1的脂肪酶lip09也表现出较高的热稳定性，其在60℃保温30min仍保留96％的活性。haki g d等(developments in industrially important thermostable enzymes:areview.bioresource technology(2003))发现，来源于微生物bacillus thermoleovorans和rhizopus oryzae的脂肪酶在70～75℃时仍然能正常发挥功能。此外，部分热稳定性好的脂肪酶对有机溶剂(如正己烷、二甲基亚砜)也有较强的耐受性。
4、然而，少部分来自嗜热菌的脂肪酶耐热性并不能满足生产和应用的需求。由于在油脂加工等反应中需在高温条件下进行，而耐热性不高的脂肪酶在高温反应条件下会出现失活现象，并且尽管部分来源于嗜热菌或超嗜热菌的脂肪酶具有较好的热稳定性，但嗜热微生物往往需要极端且昂贵的培养条件。因此若以其作为生产菌来分离纯化脂肪酶，成本较高且操作复杂。因此，研究出一种脂肪酶突变体，提高脂肪酶的热稳定性对脂肪酶在油脂加工等需要高温反应条件的应用具有重要价值。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供一种脂肪酶突变体及其应用。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种脂肪酶突变体lipa1，其氨基酸序列如seq id no.3所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4、本专利技术提供的脂肪酶突变体lipa1是在来源于铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)的脂肪酶lipa的基础上，将其第63位的精氨酸(arg)突变为半胱氨酸(cys)。所述脂肪酶lipa的氨基酸序列如seq id no.1所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、一种脂肪酶突变体lipa2，其氨基酸序列如seq id no.5所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。
6、本专利技术提供的脂肪酶突变体lipa2是在脂肪酶突变体lipa1的基础上，将其第115位的精氨酸(arg)突变为谷氨酰胺(gln)。
7、一种脂肪酶突变体lipa5，其氨基酸序列如seq id no.7所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。
8、本专利技术提供的脂肪酶突变体lipa5是在脂肪酶突变体lipa2的基础上，将其第149位的脯氨酸(pro)突变为丝氨酸(ser)、第202位的谷氨酰胺(gln)突变为谷氨酸(glu)、第269位的异亮氨酸(ile)突变为丝氨酸(leu)。
9、一种重组载体，是在质粒载体中插入上述脂肪酶突变体的编码基因。
10、根据本专利技术优选的，所述质粒载体为ppic9k。
11、一种重组菌株，是将上述重组载体转化入宿主菌株中获得。
12、根据本专利技术优选的，所述宿主菌株为毕赤酵母gs115。
13、上述脂肪酶突变体在食品加工中的应用。
14、上述脂肪酶突变体在非水相酶法合成聚合物中的应用。
15、进一步优选的，所述聚合物为6-o-pga-l-抗坏血酸。
16、本专利技术的有益效果在于：
17、本专利技术以脂肪酶lipa为基础，提供了包含r63c单点突变的脂肪酶突变体lipa1、包含r63c和r115q两点突变的脂肪酶突变体lipa2、以及包含r63c、r115q、p149s、q202e、i269l五点突变的脂肪酶突变体lipa5。与脂肪酶lipa相比，本专利技术提供的脂肪酶突变体lipa1、lipa2和lipa5的最适作用温度和ph没有发生改变，其最适温度均为50℃，最适ph均为8.0，但其热稳定性得到显著提升，在70℃保温30min后，脂肪酶lipa的残留酶活仅剩余19％，而脂肪酶突本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种脂肪酶突变体LipA1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种脂肪酶突变体LipA2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；是将权利要求1所述的脂肪酶突变体氨基酸序列中第115位的精氨酸突变为谷氨酰胺。
3.一种脂肪酶突变体LipA5，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；是将权利要求2所述的脂肪酶突变体氨基酸序列中第149位的脯氨酸突变为丝氨酸、第202位的谷氨酰胺突变为谷氨酸、第269位的异亮氨酸突变为丝氨酸。
4.一种重组载体，其特征在于，是在质粒载体中插入权利要求1～3任一项所述的脂肪酶突变体的编码基因。
5.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述质粒载体为pPIC9K。
6.一种重组菌株，其特征在于，是将权利要求5所述重组载体转化入宿主菌株中获得。
7.如权利要求6所述的重组菌株，
8.权利要求1～3任一项所述的脂肪酶突变体在食品加工中的应用。
9.权利要求1～3任一项所述的脂肪酶突变体在非水相酶法合成聚合物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶突变体lipa1，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.3所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
2.一种脂肪酶突变体lipa2，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.5所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；是将权利要求1所述的脂肪酶突变体氨基酸序列中第115位的精氨酸突变为谷氨酰胺。
3.一种脂肪酶突变体lipa5，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.7所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.8所示；是将权利要求2所述的脂肪酶突变体氨基酸序列中第149位的脯氨酸突变为丝氨酸、第202位的...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱云峰，苏移山，李想，张兆倩，朱希强，
申请(专利权)人：山东丰金美业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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