【技术实现步骤摘要】
本申请属于生物医药工程领域，特别涉及一种人工核酸分子及其制备方法和应用。
技术介绍
1、mrna翻译合成蛋白的过程十分复杂，并且受到多种因素调控。研究表明，mrna的5’和3’utr与转录后调控密切相关，可对包括mrna转运、降解、亚细胞定位以及翻译效率在内的许多方面产生影响。其中，3’utr主要参与mrna转录过程的调节，而5’utr主要参与目的蛋白翻译过程的调节，对转录后mrna的稳定、折叠及核糖体识别和结合等阶段产生影响。5’utr含有内部核糖体进入位点(ires)，因此具有介导内部翻译起始的功能。高度结构化的5’utr对mrna翻译起始的调控主要有三种途径：(1)通过本身高度复杂的二级结构在空间上阻碍翻译起始；(2)通过上游元件来抑制翻译起始；(3)通过内部核糖体进入位点(ires)元件的“非帽依赖”起始途径来抑制翻译起始。
2、现有研究表明，5’utr的结构可以影响mrna的稳定性，进而影响基因表达的效率。真核生物5’utr的5’端具有一个帽子结构，是真核核糖体识别mrna的结构信号，帽类似物(如m7gmp和m7gdp等)会强烈抑制带帽mrna的翻译。5’utr的序列、长度、二级结构(例如茎环结构)以及与某些结合蛋白的相互作用还可以对mrna的半衰期产生影响，进而实现对mrna的稳定性进行调控。
3、现有研究表明，在生物进化过程中，3’utr的长度变化较之5’utr更加明显，其长度变化与物种形态复杂性存在关联，较长的3’utr可能会包含多个聚腺苷酸化信号，产生一些含有不同mirna结合位点的转录
4、目前，核酸类药物研发的主要难点在于其体外表达中的稳定性和规模化水平，因此，如何借助其自身结构而非外部生产调节来实现这一目的，成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种人工核酸分子，以及该人工分子的制备方法和其在制备生物制品(特别是疫苗)中的应用。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术一方面提供了一种人工核酸分子，包括5’端调控序列、连接在所述5’端调控序列下游的至少一个开放阅读框、以及连接在所述开放阅读框下游的3’端调控序列；
4、所述开放阅读框编码病毒免疫原性蛋白；
5、所述5’端调控序列包含一个5’utr元件，所述5’utr元件源自哺乳动物功能蛋白基因，并且其中uorf片段被部分或完全去除；所述功能蛋白为与肝脏功能相关的球状蛋白；
6、所述3’端调控序列包含一个3’utr元件和至少一组poly(a)尾顺式作用元件；所述3’utr元件与所述poly(a)顺式作用元件均源自哺乳动物功能蛋白基因，包括poly(a)信号和poly(a)位点，优选地还包括下游作用元件；当具有多组所述poly(a)尾顺式作用元件时，任意两组所述poly(a)尾顺式作用元件具有相同序列的poly(a)尾信号和不同序列的poly(a)位点，优选地还具有不同序列的下游作用单元。
7、专利技术人通过研究发现，本申请提供的特定的5’端非翻译区结构与3’端非翻译区结构联合使用，可以对转录过程进行有效调控，从而促进目的蛋白高效、稳定地表达。
8、进一步地，所述哺乳动物为人，所述球状蛋白具有催化功能(作为酶催化机体内生化反应)、运输功能(在机体内进行物质转移和运输)、贮存功能(在必须时为生物体提供c、h、o、n、s、fe等元素)、防御功能(通过免疫反应抵抗外源异种蛋白对生物体的干扰)以及保护功能(维持机体和组织功能状态稳定)中的至少一种，例如珠蛋白(例如α-珠蛋白或β-珠蛋白)、辅酶(例如还原型辅酶叶绿醇)、白蛋白、补体或细胞色素代谢酶等，优选为人白蛋白、补体或细胞色素氧化酶。
9、研究发现，采用上述基因的5’非编码区片段作为本申请中的调控元件，相比于其他种类的5’非编码区(特别是原核生物基因)可以更有效地实现目的蛋白表达的调控。
10、进一步地，所述5’utr元件选自人白蛋白基因、补体基因或细胞色素氧化酶基因中任一种的5’utr或其同源物、片段或变体。
11、进一步地，所述5’utr元件序列来自seq id no.31～33中任一项所述的序列(依次来自人白蛋白基因、补体基因或细胞色素氧化酶基因)。
12、在另一些实施方式中，所述5’utr元件可以来自moderna的mrna-1273(genbank:mz362876.1)，其序列如seq id no.47所示；或者pfizer的5’utr序列(wo2017059902a1)，其序列如seq id no.48所示。
13、进一步地，所述5’端调控序列还包括连接在所述5’utr元件下游的kozak序列。
14、进一步地，所述3’utr元件为人白蛋白基因3’utr或其同源物、片段或变体，所述poly(a)尾顺式作用元件为人白蛋白基因中至少一组poly(a)尾顺式作用元件或其同源物、片段或变体。
15、研究发现，采用上述基因的3’非编码区片段作为本申请中的调控元件，相比于其他种类的3’非编码区可以更有效地实现目的蛋白表达的调控。
16、进一步地，所述poly(a)尾顺式作用元件为1组、2组或3组。
17、在一些具体的实施方式中，poly(a)尾顺式作用元件仅有1组，即在3’utr下游依次连接有第一poly(a)信号和第一poly(a)位点(例如seq id no.34所示的序列，其中第1～165位为3’utr元件，166～171位为第一poly(a)信号，172～188位为第一poly(a)位点)。
18、在一些具体的实施方式中，poly(a)尾顺式作用元件仅有1组，即在3’utr下游依次连接有第一poly(a)信号、第一poly(a)位点和第一下游作用元件。
19、在一些具体的实施方式中，poly(a)尾顺式作用元件有2组，即在3’utr下游依次连接有第一poly(a)信号、第一poly(a)位点、第一下游作用元件、第二poly(a)信号和第二poly(a)位点(例如seq id no.35所示的序列，其中第1～165位为3’utr元件，166～171位为第一poly(a)信号，172～188位为第一poly(a)位点，189～320位为第一下游作用元件，321～326位为第二poly(a)信号，327～344位为第二p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人工核酸分子，其特征在于，包括5’端调控序列、连接在所述5’端调控序列下游的至少一个开放阅读框、以及连接在所述开放阅读框下游的3’端调控序列；
2.如权利要求1所述的人工核酸分子，其特征在于，所述哺乳动物为人，所述球状蛋白具有催化功能、运输功能、贮存功能、防御功能以及保护功能中的至少一种；优选地，所述球状蛋白为人白蛋白、补体或细胞色素氧化酶中的任一种。
3.如权利要求2所述的人工核酸分子，其特征在于，所述5’UTR元件选自人白蛋白基因、补体基因或细胞色素氧化酶基因中任一种的5’UTR或其同源物、片段或变体。
4.如权利要求3所述的人工核酸分子，其特征在于，所述5’UTR元件序列来自SEQ IDNo.31～33中任一项所述的序列。
5.如权利要求4所述的人工核酸分子，其特征在于，所述5’端调控序列还包括连接在所述5’UTR元件下游的Kozak序列。
6.如权利要求2所述的人工核酸分子，其特征在于，所述3’UTR元件为人白蛋白基因3’UTR或其同源物、片段或变体，所述poly(A)尾顺式作用元件为人白蛋白基因中至少一
7.如权利要求6所述的人工核酸分子，其特征在于，所述poly(A)尾顺式作用元件为1组、2组或3组。
8.如权利要求7所述的人工核酸分子，其特征在于，所述3’端调控序列来自SEQ IDNo.34～36中任一项所述的序列。
9.如权利要求1～8中任一项所述的人工核酸分子，其特征在于，还包括连接在所述poly(A)尾顺式作用元件下游的poly(A)序列。
10.如权利要求9所述的人工核酸分子，其特征在于，所述poly(A)序列的长度为60～120nt，优选为80nt。
11.如权利要求8所述的人工核酸分子，其特征在于，还包括位于所述5’端调控序列上游的上游酶切位点、位于所述poly(A)尾顺式作用元件下游的线性化酶切位点、以及位于所述3’端调控序列下游的下游酶切位点。
12.一种促进蛋白表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
13.权利要求1～11中任一项所述的人工核酸分子在制备生物制品中的应用。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述生物制品为疫苗，所述开放阅读框为编码病原体抗原蛋白的开放阅读框。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述生物制品为功能蛋白，所述开放阅读框为编码功能蛋白的开放阅读框。
16.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求1～11中任一项所述的人工核酸分子以及递送载体，所述人工核酸分子均匀分散并包裹在所述递送载体中。
17.如权利要求16所述的疫苗，其特征在于，所述递送载体为脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒或无机纳米颗粒。
18.如权利要求17所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗选自新冠疫苗、HPV疫苗、肠道病毒疫苗、结核疫苗、HSV疫苗、VZV疫苗、流感疫苗、CMV疫苗以及RSV疫苗中的至少一种。
...【技术特征摘要】
1.一种人工核酸分子，其特征在于，包括5’端调控序列、连接在所述5’端调控序列下游的至少一个开放阅读框、以及连接在所述开放阅读框下游的3’端调控序列；
2.如权利要求1所述的人工核酸分子，其特征在于，所述哺乳动物为人，所述球状蛋白具有催化功能、运输功能、贮存功能、防御功能以及保护功能中的至少一种；优选地，所述球状蛋白为人白蛋白、补体或细胞色素氧化酶中的任一种。
3.如权利要求2所述的人工核酸分子，其特征在于，所述5’utr元件选自人白蛋白基因、补体基因或细胞色素氧化酶基因中任一种的5’utr或其同源物、片段或变体。
4.如权利要求3所述的人工核酸分子，其特征在于，所述5’utr元件序列来自seq idno.31～33中任一项所述的序列。
5.如权利要求4所述的人工核酸分子，其特征在于，所述5’端调控序列还包括连接在所述5’utr元件下游的kozak序列。
6.如权利要求2所述的人工核酸分子，其特征在于，所述3’utr元件为人白蛋白基因3’utr或其同源物、片段或变体，所述poly(a)尾顺式作用元件为人白蛋白基因中至少一组poly(a)尾顺式作用元件或其同源物、片段或变体。
7.如权利要求6所述的人工核酸分子，其特征在于，所述poly(a)尾顺式作用元件为1组、2组或3组。
8.如权利要求7所述的人工核酸分子，其特征在于，所述3’端调控序列来自seq idno.34～36中任一项所述的序列。
9.如权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：郗永义，徐洋瑞，魏一，张元杰，胡颖嵩，姚文荣，洪坤学，刘勇，
申请(专利权)人：江苏瑞科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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